利用兔眼角膜上皮細胞評價供試品是否具有眼刺激性

【評價原理】

化合物直接作用于角膜引起的刺激作用類似于細胞毒性損傷作用，通過檢測細胞毒性指標(biāo)，可反映角膜損傷的程度。試驗采用體外培養(yǎng)的兔角膜上皮細胞（SIRC），短時暴露于供試品，模擬急性角膜刺激作用，通過計算細胞相對存活率來預(yù)測供試品引起的眼睛損傷。

【實驗方案】

取穩(wěn)定生長狀態(tài)的細胞,調(diào)整細胞濃度為3×104/mL，按每孔200μL細胞懸液接種于96孔板（6000個細胞/孔）中（除最外周孔）。設(shè)置空白對照、培養(yǎng)基對照、溶劑對照、陽性對照組和供試品組。放人二氧化碳培養(yǎng)箱中常規(guī)條件培養(yǎng)48h。換液，去除完全培養(yǎng)基，PBS清2次，加新鮮完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h。待上述培養(yǎng)的細胞融合度達80%以上時暴露于200μL5%和0.05%供試品溶液中，染毒5min，每個樣品做3個復(fù)孔，同時將做相應(yīng)的處理。染毒結(jié)束，用200μL磷酸鹽緩沖液沖洗2次。

然后每孔中加入200μLMTT（0.5mg/mL）溶液，放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，倒出MTT溶液，加入200μL0.04N酸化異丙醇作用60min提取MTT甲瓚（室溫暗室中操作），然后在多功能酶標(biāo)儀中測定570nm處吸光度值(OD570值)。根據(jù)OD值計算細胞存活率。

每個樣品需重復(fù)三次試驗。當(dāng)5%和0.05%濃度的受試物的細胞存活率均大于70%時，則判斷該受試物眼刺激強度為無刺激性或微刺激性；當(dāng)5%和0.05%濃度的受試物的細胞存活率均≤70%時，則判斷該受試物眼刺激強度為腐蝕性(不可逆眼損傷)；若受試物0.05%濃度溶液的細胞存活率大于70%，而5%濃度溶液的細胞存活率≤70%時，則需加做其他試驗加以判定。

【評價指標(biāo)】

細胞存活率

【結(jié)果展示】

1、供試品刺激反應(yīng)分級表

【評價結(jié)論】

1、供試品1在5%和0.05%濃度的細胞存活率均≤70%時，則判斷該受試物眼刺激強度為腐蝕性(不可逆眼損傷)；供試品2在5%和0.05%濃度的細胞存活率均大于70%時，則判斷該供試品眼刺激強度為無刺激性或微刺激性。

參考文獻：

[1] 化妝品用化學(xué)原料體外兔角膜上皮細胞短時暴露試驗Short Time Exposure In Vitro Test Method (STE)