利用斑馬魚(yú)評(píng)價(jià)供試品舒緩功效

【實(shí)驗(yàn)原理】

暴露于生活環(huán)境中的皮膚，接觸到有毒有害物質(zhì)后可能引起一定程度的皮膚炎癥，出現(xiàn)皮膚紅腫、瘙癢等現(xiàn)象。一些醫(yī)美類(lèi)化妝品除具有常規(guī)護(hù)膚功效外還能起到舒緩作用。通過(guò)斑馬魚(yú)技術(shù)能有效評(píng)價(jià)供試品舒緩功效。

1、化妝品對(duì)皮膚的刺激表型主要表現(xiàn)為皮膚炎癥，炎癥早期主要表現(xiàn)為毛細(xì)血管擴(kuò)張、通透性亢進(jìn)和水腫。十二烷基磺酸鈉（SLS）是人體皮膚刺激物模型斑貼試驗(yàn)常見(jiàn)的陽(yáng)性對(duì)照物，SLS刺激后能誘發(fā)表皮炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，刺激物進(jìn)入斑馬魚(yú)體內(nèi)，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，中性粒細(xì)胞發(fā)生免疫應(yīng)答，向皮膚表皮遷移并聚集。

2、TNF-α在機(jī)體受到刺激時(shí)會(huì)大量產(chǎn)生,主要來(lái)自于活化的巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞；IL-6 能夠促進(jìn)中性粒細(xì)胞功能上調(diào)，促進(jìn)和調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、黏附分子以及一氧化氮等炎癥介質(zhì)分泌；IL-8 由單核細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌生成，炎癥發(fā)生時(shí)其水平迅速升高。IL-1 在炎癥反應(yīng)中傳遞信息、激活以及調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞、增殖與分化炎癥其關(guān)鍵作用。若供試品具有能夠降低TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8 等炎癥因子水平的作用，則說(shuō)明其具有舒緩的功效。

3、肥大細(xì)胞是類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，激活的肥大細(xì)胞數(shù)量與過(guò)敏程度相關(guān)，激活的肥大細(xì)胞越多，過(guò)敏程度越嚴(yán)重。類(lèi)胰蛋白酶(Tryptase )是肥大細(xì)胞內(nèi)預(yù)先合成的中性蛋白酶，是含量最多的介質(zhì)，在肥大細(xì)胞中的儲(chǔ)存和表達(dá)有高度的選擇性。肥大細(xì)胞脫顆粒后，類(lèi)胰蛋白酶會(huì)轉(zhuǎn)化成具有活性的構(gòu)象并被釋放到細(xì)胞外，Tryptase可作為肥大細(xì)胞脫顆粒的標(biāo)志。

4、斑馬魚(yú)受到疼痛時(shí)會(huì)產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)軌跡上的變化。通過(guò)測(cè)定斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)軌跡作為傷害性感受閾的測(cè)量指標(biāo)。

【實(shí)驗(yàn)方法】

將受測(cè)試斑馬魚(yú)分成三組，分別是正常對(duì)照組、模型對(duì)照組和供試品組。正常對(duì)照組不做處理，模型對(duì)照組僅用SLS處理，供試品組在用SLS的同時(shí)添加受試化妝品。孵育一段時(shí)間后：

1、將斑馬魚(yú)整體放到熒光顯微鏡下拍照，統(tǒng)計(jì)皮膚表面中性粒細(xì)胞數(shù)量

2、利用Q-PCR檢測(cè)IL-6等基因相對(duì)表達(dá)量

3、利用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組吸光度值（OD值），以O(shè)D值分析類(lèi)胰蛋白酶含量、過(guò)敏程度

4、利用斑馬魚(yú)行為分析儀檢測(cè)斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)距離，定量評(píng)價(jià)供試品的神經(jīng)舒緩的效果

【評(píng)價(jià)指標(biāo)】

1、皮膚中性粒細(xì)胞數(shù)量

2、炎癥因子IL-1α、IL-6、IL-8、TNFα分泌量

3、過(guò)敏反應(yīng)標(biāo)志物（類(lèi)胰蛋白酶）含量

4、神經(jīng)舒緩-總運(yùn)動(dòng)距離

【結(jié)果展示】

（*展示圖片僅供參考，實(shí)際實(shí)驗(yàn)組別依據(jù)合同而定）

1、皮膚中性粒細(xì)胞數(shù)量

圖1.皮膚中性粒細(xì)胞表型圖 

黃色虛線(xiàn)區(qū)域?yàn)橛?jì)算區(qū)域，綠色熒光點(diǎn)為中性粒細(xì)胞

2、炎癥因子表達(dá)水平：提供柱狀圖

圖2.斑馬魚(yú)IL-6基因相對(duì)表達(dá)量

3、類(lèi)胰蛋白酶含量：提供柱狀圖

圖3.類(lèi)胰蛋白含量柱形圖 

4、神經(jīng)舒緩（鎮(zhèn)痛）-總運(yùn)動(dòng)距離（軌跡圖、柱狀圖，略）

圖4.斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)軌跡圖 

【評(píng)價(jià)結(jié)論】

供試品斑馬魚(yú)中性粒細(xì)胞數(shù)量、炎癥因子表達(dá)量、類(lèi)胰蛋白酶的量與模型對(duì)照組相比，明顯減少；斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)距離與模型對(duì)照組相比，明顯減少；本實(shí)驗(yàn)證明該供試品具有舒緩功效。

【參考文獻(xiàn)】

[1]王濤. 丹參酮I的抗炎作用及安全性評(píng)價(jià)[D]. 廣東藥科大學(xué), 2018.

[2] Miskolci V, Squirrell J, Rindy J, et al. Distinctin flammatory and wound healing response stocomplex caudal fin injurie soflarval zebrafish[J]. Elife. 2019, 8.

[3] Lavens S E, Proud D, Warner J A. A sensitive colorimetric assay for the release of tryptase from human lung mast cells in vitro[J]. journal of immunological methods, 1993, 166(1):93-102.

[4] Solley G O, Gleich G J, Jordon R E. et al. The late phase of the immediate wheal and flare skin reaction. Its dependence upon IgE antibodies. [J]. Journal of Clinical Investigation, 1976, 58(2):408-420.

[5] 李春?jiǎn)?勞喬聰和俞航萍. 一種斑馬魚(yú)類(lèi)過(guò)敏檢測(cè)模型的建立及其應(yīng)用: CN201310262123.8 [P]. 2013-06-27.

[6] DUBNER R. Methods of assessing pain in animals. in: Wall P.D. and Melzack R. (eds.): textbook of pain[M].1994: 293-302

[7] 周海鷗, 余躍, 施燕, 徐其遠(yuǎn), 張琳琳. 不同劑量烏司他丁對(duì)急性胰腺炎患者血清TNF-α，IL-1，IL-6及IL-8 水平的影響[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2017, 17(21): 4096-4099

[8] 李曉, 董立園, 李曉玉, 王瑞敏, 李國(guó)華. 宮內(nèi)感染致肺損傷仔鼠血清IL-21與TNF-α及MMP-9表達(dá)水平[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志. 2021. 31(16): 2497-2501