項(xiàng)目一：細(xì)胞活性保護(hù)比率
【實(shí)驗(yàn)原理】
藍(lán)光波長(zhǎng)比紫外線長(zhǎng)，具有較強(qiáng)的穿透力，能夠穿透皮膚表皮抵達(dá)真皮層,引起一系列的炎癥反應(yīng)和線粒體損傷，最終誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡甚至腫瘤的發(fā)生。采用藍(lán)光光源照射人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT，會(huì)出現(xiàn)一定的細(xì)胞毒性，抑制細(xì)胞增殖。計(jì)算添加和不添加樣品對(duì)于細(xì)胞的保護(hù)比率，以此評(píng)價(jià)樣品是否具有藍(lán)光防護(hù)功效。
【實(shí)驗(yàn)步驟】
實(shí)驗(yàn)一：MTT法檢測(cè)某化妝品對(duì)HaCaT的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
1）細(xì)胞接種：接種細(xì)胞于96孔板內(nèi)（1×10^4 個(gè)/孔），于37 ℃，5% CO2中培養(yǎng)24 h。
2）給藥：樣品組加入相應(yīng)濃度的含樣品的培養(yǎng)基，正常對(duì)照組更換為新鮮培養(yǎng)基，空白組加入空白培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2孵育24 h。
3）孵育結(jié)束后向每孔中加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。
4）去培養(yǎng)液，加入DMSO溶液，振蕩混勻，測(cè)定490 nm處吸光度值。
OD490：490 nm處的吸光度值
實(shí)驗(yàn)二：MTT法檢測(cè)某化妝品抗藍(lán)光保護(hù)
1）細(xì)胞接種：準(zhǔn)備2塊96孔板，將HaCaT細(xì)胞以1×10^4的密度接種于96孔板中，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。1號(hào)板設(shè)置為未添加樣品的非光照組，2號(hào)板設(shè)置為未添加樣品的光照組（模型組）和添加樣品的光照組。
2）給藥：細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，取出2號(hào)板，加樣品處理，另設(shè)空白對(duì)照（無(wú)細(xì)胞+完全培養(yǎng)基）,然后將2塊板放入37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。
3）造模：將2號(hào)板放入藍(lán)光暗箱里照射3 h，1號(hào)板繼續(xù)在37 ℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)3 h。
4）收樣檢測(cè)：照射結(jié)束后，MTT法測(cè)定490 nm處吸光度值。根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞活性保護(hù)比率（A）。
式中：
A：細(xì)胞活性保護(hù)比率；
CV：細(xì)胞活力值；
CVd1：添加樣品的光照組細(xì)胞的細(xì)胞活力值；
CVe1：未添加樣品的光照組細(xì)胞的細(xì)胞活力值；
CVe0：未添加樣品的非光照組細(xì)胞的細(xì)胞活力值；
【評(píng)價(jià)指標(biāo)】保護(hù)比率（A）
【評(píng)價(jià)結(jié)論】A ≥ 1.5，判定為樣品在該濃度下具有藍(lán)光防護(hù)能力。
【參考文獻(xiàn)】
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[2] 夏艾婷.葉黃素對(duì)藍(lán)光誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制的研究[D].安徽醫(yī)科大學(xué).
項(xiàng)目二：ROS清除率
【實(shí)驗(yàn)原理】
皮膚位于人體的最外層，保護(hù)我們免受各種外部因素的影響，包括陽(yáng)光、污染物和壓力。陽(yáng)光是影響皮膚的最大因素之一，主要由紫外線(UV)、可見(jiàn)光和紅外光組成，具體取決于能量和波長(zhǎng)。在各種波長(zhǎng)中，由于智能手機(jī)、筆記本電腦、電腦和電視等電子設(shè)備在日常生活中的廣泛使用，藍(lán)光(380-500納米)，也稱(chēng)為高能可見(jiàn)光，尤其受到關(guān)注。據(jù)報(bào)道，過(guò)度暴露于藍(lán)光會(huì)對(duì)皮膚細(xì)胞造成多種損傷，包括氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和增殖能力下降等。。因此，本實(shí)驗(yàn)擬檢測(cè)ROS清除率，以此維度判斷樣品是否具有抗藍(lán)光保護(hù)作用。
【實(shí)驗(yàn)方法】
實(shí)驗(yàn)一：MTT法檢測(cè)某化妝品對(duì)HaCaT的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
1）細(xì)胞接種：接種細(xì)胞于96孔板內(nèi)（1×10^4 個(gè)/孔），于37 ℃，5% CO2中培養(yǎng)24 h。
2）給藥：樣品組加入相應(yīng)濃度的含樣品的培養(yǎng)基，正常對(duì)照組更換為新鮮培養(yǎng)基，空白組加入空白培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2孵育24 h。
3）孵育結(jié)束后向每孔中加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。
4）去培養(yǎng)液，加入DMSO溶液，振蕩混勻，測(cè)定490 nm處吸光度值。
OD490：490 nm處的吸光度值
實(shí)驗(yàn)二：樣品對(duì)藍(lán)光輻射后HaCaT的ROS清除效率
1) 細(xì)胞接種：將HaCaT以2 × 10^4個(gè)/孔接種于96孔板，于培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中培養(yǎng)12 h，分別設(shè)置正常對(duì)照組（0 mM樣品）、模型對(duì)照組（藍(lán)光輻射3 h+0 mM樣品）、低濃度組（藍(lán)光輻射3 h+A mM樣品）、中濃度組（藍(lán)光輻射2 h+B mM樣品）、高濃度組（藍(lán)光輻射3 h + C mM樣品）。
2) 給藥預(yù)處理：各試驗(yàn)組中分別加入含有不同濃度樣品的 DMEM 培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)24 h；
3) 藍(lán)光造模：藍(lán)光輻射前HaCaT用D’Hanks洗3遍，在孔中加入 50 ul D’Hanks，使之浸沒(méi)細(xì)胞，對(duì)照組用錫紙包住置暗處。針對(duì)試驗(yàn)分組，對(duì)需要輻射的組分別進(jìn)行藍(lán)光造模 3 h；
4) 給藥：各試驗(yàn)組中分別加入含有不同濃度樣品的 DMEM 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h；
5) ROS熒光探針轉(zhuǎn)載：按照1:1000的稀釋比例，采用PBS稀釋DCFH-DA至終濃度為10 μmol/L。除裸細(xì)胞孔外，棄掉其余孔中的培養(yǎng)基，用PBS清洗3次后，每孔加入200 ul DCFH-DA工作液，CO2培養(yǎng)箱孵育30 min，孵育結(jié)束后，PBS清洗各孔內(nèi)細(xì)胞3次；
6） 熒光分析。將待測(cè)96孔板置于熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)臺(tái)上，設(shè)置入射光波長(zhǎng)525 nm，激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm，讀數(shù)分析。
7） 計(jì)算。根據(jù)各組實(shí)驗(yàn)熒光強(qiáng)度，計(jì)算樣品對(duì)ROS的清除效率。
注：本實(shí)驗(yàn)方法中的樣品的濃度和輻射劑量因?qū)嶒?yàn)一而定。
【評(píng)價(jià)指標(biāo)】ROS清除率
【評(píng)價(jià)結(jié)論】
與模型對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中樣品對(duì)ROS的清除率具有顯著性上調(diào)且呈現(xiàn)劑量相關(guān)性（P＜0.05），初步證明樣品具有抗藍(lán)光保護(hù)作用。
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