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項目一：黑色素含量測定
【實驗原理】
體內(nèi)黑色素主要由位于表皮基底細胞層的黑色素細胞產(chǎn)生，是一種由細胞本身所合成、分泌不溶于水，溶于堿性溶液的生物色素。黑色素的產(chǎn)生過程受多因素調(diào)控，其中外界刺激(尤其是紫外線照射)、炎癥反應和α-MSH激動劑均可觸發(fā)或影響黑色素的合成過程。本實驗利用人黑素瘤細胞在樣品作用下通過NaOH裂解法檢測黑色素含量進而評價樣品是否具有美白功效。^
【實驗步驟】
實驗一：MTT法檢測樣品對人黑色素瘤細胞的細胞毒性實驗
1）細胞接種：接種細胞于96孔板內(nèi)（1 × 10^4個/孔），于37 ℃，5% CO2中培養(yǎng)24 h。
2）給藥：樣品組加入相應濃度的含樣品的培養(yǎng)基，正常對照組更換為新鮮培養(yǎng)基，空白組加入空白培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2孵育24 h。
3）孵育結(jié)束后向每孔中加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。
4）去培養(yǎng)液，加入DMSO溶液，振蕩混勻，測定490 nm處吸光度值。
OD490：490 nm處的吸光度值
實驗二：人黑色素瘤細胞的黑色素含量測定實驗
1）細胞接種：接種細胞于12孔平板（5 × 104個/孔），于37 ℃，5% CO2孵育24 h。
2）造模+給藥：去除培養(yǎng)液，用D-Hanks輕柔沖洗細胞一次或兩次。正常對照組更換為新鮮培養(yǎng)基，樣品組更換為含造模劑（α-MSH）和樣品的新鮮培養(yǎng)基，模型對照組更換為含造模劑（α-MSH）的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)于37 ℃，5% CO2孵育48 h。
3）收樣檢測：孵育結(jié)束后，去除培養(yǎng)液，用D-Hanks輕柔沖洗細胞一次或兩次，每孔加入200 μL 1mol/L的NaOH溶液（含10% DMSO），60 ℃孵育1 h.。將12孔板中各組的細胞溶出物轉(zhuǎn)移到96孔板中，在475 nm處測定各孔的吸光度值。
注：上述給藥濃度均來MTT實驗摸索而定。
【評價指標】
黑色素含量
【評價結(jié)論】
供試品組與對照組相比，黑色素含量下調(diào)且具有顯著性差異（P＜0.05），初步證明該樣品具有美白功效。
【參考結(jié)論】
[1] 殷珊.梔子黃色素對小鼠B16黑素瘤細胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素生成影響的實驗研究[D].湖南中醫(yī)藥大學.
[2] 莊文越,蘇小明,趙鳴瑤,等.安五脂素對α-黑色素細胞刺激素誘導的小鼠黑色素瘤B16F10細胞中黑色素生成的影響及機制[J].中國藥理學與毒理學雜志,2022,36(5):6.
[3] 解士海, 黃榮云, 趙衛(wèi)華,等. 紫草素對人黑素瘤細胞增殖及黑素合成的影響[J]. 臨床合理用藥雜志, 2010, 3(9):10-12.
[4] 劉邦民, 張涓, 陶春蓉,等. 驗方祛斑湯含藥血清對A375人黑素瘤細胞黑素合成的影響[J]. 美中醫(yī)學：英文版, 2007, 4(6):4.
項目二：酪氨酸酶活性測定
【實驗原理】
酪氨酸酶是黑色素合成的關鍵限速酶，在治療色素障礙性皮膚病中，酪氨酸酶抑制劑發(fā)揮著重要作用，近年來，以酪氨酸酶抑制劑作為美白劑開發(fā)的美白祛斑產(chǎn)品均能達到一定功效。通過多巴氧化法檢測樣品對人黑素瘤細胞（A375）中酪氨酸酶活性是否降低，來判斷樣品是否具有美白功效。
【實驗步驟】
1）細胞接種：接種人黑素瘤細胞（A375）于96孔板中，每孔5 × 104 個，37 ℃培養(yǎng)24 ± 2 h。
2）給藥：空白對照組（不含細胞）和正常對照組（含細胞）加入完全培養(yǎng)基，樣品組加入含相應濃度樣品的完全培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2孵育48 h。
3）收樣檢測：孵育結(jié)束后，去培養(yǎng)基，采用多巴氧化法測酪氨酸酶活性。
上述給藥濃度均來MTT實驗摸索而定。
【評價指標】
酪氨酸酶活性
【評價結(jié)論】
供試品組與對照組相比，酪氨酸酶活性上調(diào)且具有顯著性差異（P＜0.05），初步證明該樣品具有美白功效。
【參考結(jié)論】
[1]楊美花，李智聰，劉鳳嬌，莊江興，王勤，陳清西. L-半胱氨酸作為化妝品美白添加劑的作用機理[J].廈門大學學報，2009，48（4）：581-584.
[2]黃海潮，鄭公銘，王如意，張顯策，李忠軍，劉綱勇，傅中. 柯里拉京對B16細胞增殖及酪氨酸酶活性的抑制作用[J].日用化學工業(yè)，2016，46（1）：44-47.
項目三：黑素合成相關基因-MITF、TYR表達測定
【實驗原理】
皮膚是抵御各種有害刺激的物理屏障，包括紫外線照射、環(huán)境污染、機械損傷和體內(nèi)水分流失。特別是，過度的紫外線照射會導致DNA損傷和基因突變，從而導致皮膚癌的發(fā)生。因此，皮膚使用黑色素，一種由表皮基底細胞層中的黑色素細胞產(chǎn)生的天然色素，來保護皮膚免受過度的紫外線照射。黑色素的產(chǎn)生被稱為黑色素生成級聯(lián)，包括基因表達、酶反應和膜運輸。素生成級聯(lián)始于黑素細胞，通過激活G蛋白偶聯(lián)受體，黑素皮質(zhì)素1受體(MC1R)，對α-黑素細胞刺激激素(αMSH)作出反應，αMSH作為黑色素生成的內(nèi)源性誘導物，通過級聯(lián)磷酸化激活黑色素合成相關基因轉(zhuǎn)錄因子-黑素細胞誘導轉(zhuǎn)錄因子（MITF），包括黑素生物合成酶酪氨酸酶家族的基因表達，例如酪氨酸酶(TYR)。因此，本實驗利用人源黑色素瘤細胞（A375），將樣品作用于細胞后檢測MITF、TYR基因相對表達量，以此維度來評估樣品對黑色素合成的影響。
【實驗步驟】
細胞接種：接種A375細胞于6孔板中，每孔6 × 105個，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h。
造模＋給藥：去除培養(yǎng)液，用D-Hanks輕柔沖洗細胞一次或兩次。正常對照組更換為新鮮培養(yǎng)基，樣品組更換為含造模劑（α-MSH）和樣品的新鮮培養(yǎng)基，模型對照組更換為含造模劑（α-MSH）的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)于37 ℃，5% CO2孵育48 h。
收樣檢測：培養(yǎng)結(jié)束后，進行細胞收樣，提取各實驗組總RNA，合成cDNA，利用q-PCR檢測β-actin和目的基因的基因表達。
用β-actin作為基因表達的內(nèi)參，計算目的基因的RNA相對表達量。
【評價指標】
MITF、TYR基因表達
【評價結(jié)論】
供試品組與模型對照組相比MITF、TYR基因表達下調(diào)且具有顯著性差異（P＜0.05），初步證明該樣品具有美白功效。
【參考結(jié)論】
[1] Waku T, Nakada S, Masuda H, Sumi H, Wada A, Hirose S, Aketa I, Kobayashi A. The CNC-family transcription factor Nrf3 coordinates the melanogenesis cascade through macropinocytosis and autophagy regulation. Cell Rep. 2023 Jan 31;42(1):111906.
[2] 殷珊.梔子黃色素對小鼠B16黑素瘤細胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素生成影響的實驗研究[D].湖南中醫(yī)藥大學.
[3] 莊文越,蘇小明,趙鳴瑤,等.安五脂素對α-黑色素細胞刺激素誘導的小鼠黑色素瘤B16F10細胞中黑色素生成的影響及機制[J].中國藥理學與毒理學雜志,2022,36(5):6.
[4] 解士海, 黃榮云, 趙衛(wèi)華,等. 紫草素對人黑素瘤細胞增殖及黑素合成的影響[J]. 臨床合理用藥雜志, 2010, 3(9):10-12.
[5] 劉邦民, 張涓, 陶春蓉,等. 驗方祛斑湯含藥血清對A375人黑素瘤細胞黑素合成的影響[J]. 美中醫(yī)學：英文版, 2007, 4(6):4.
