（一）SASP
【評(píng)價(jià)原理】
皮膚衰老是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其伴隨著含水量降低，新陳代謝減慢，免疫力下降等多個(gè)過(guò)程，皮膚衰老的特征是失去彈性、松弛、出現(xiàn)皺紋和粗糙的外觀等。但是，衰老(senescence)是生物體組織、器官以及細(xì)胞的功能隨時(shí)間而逐漸喪失的漸進(jìn)過(guò)程。通過(guò)連續(xù)培養(yǎng)人二倍體細(xì)胞的方法得到衰老細(xì)胞模型即復(fù)制性衰老，耗時(shí)較長(zhǎng)，很難在短期時(shí)間內(nèi)獲得大量背景一致的衰老細(xì)胞群體，因此給衰老相關(guān)的科學(xué)研究帶來(lái)很多困難。在應(yīng)用于衰老過(guò)程的臨床前沿醫(yī)學(xué)研究的細(xì)胞模型中，人角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞是最常用的細(xì)胞模型。到目前為止，大多學(xué)者都采用紫外線輻射誘導(dǎo)細(xì)胞提前衰老模型。由于 UVB 輻射誘導(dǎo)細(xì)胞早衰模型符合日光照射引起細(xì)胞衰老的特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于抗衰老藥物的篩選和潛在藥理機(jī)制的研究。
本研究擬用 UVB 輻射成纖維細(xì)胞以建立 UVB 所致成纖維細(xì)胞 提前衰老模型，以待測(cè)樣品為干預(yù)因素，檢測(cè)衰老相關(guān)分泌表型(SASP)的表達(dá)（IL6/TNFα/MMP3），以樣品的抗衰老功效。
實(shí)驗(yàn)方案
實(shí)驗(yàn)一：MTT 法檢測(cè)樣品對(duì)成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
1）細(xì)胞接種：接種細(xì)胞于 96孔板內(nèi)（1× 10^4個(gè)/孔），于37 ℃，5%CO2中培養(yǎng)24 h。
2）給藥：樣品組加入相應(yīng)濃度的含樣品的培養(yǎng)基，正常對(duì)照組更換為新鮮培養(yǎng)基，空白組加入空白培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2孵育 24 h。
3）孵育結(jié)束后向每孔中加入 MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。
4）去培養(yǎng)液，加入 DMSO 溶液，振蕩混勻，測(cè)定 490 nm 處吸光度值。
OD490：490 nm 處的吸光度值
實(shí)驗(yàn)二：樣品對(duì) UVB 老化處理后成纖維細(xì)胞的 SASP(IL6/TNFα/MMP3)表達(dá)量
1） 細(xì)胞接種：將成纖維細(xì)胞以 2 × 10^5 個(gè)/孔接種于 6 孔板，于培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中培養(yǎng) 12 h，分別設(shè)置對(duì)照組（X mJ/cm2+0 mM 樣品）、UVB 照射低濃度組（30 mJ/cm2+AmM 樣品）、UVB 照射中濃度組（30 mJ/cm2 +B mM 樣品）、UVB 照射高濃度組（30 mJ/cm2+ C mM 樣品）。
2） UVB 老化處理：UVB 輻射前成纖維細(xì)胞用 D’Hanks 洗 3 遍，在孔中加入 1 mL D’Hanks，使之浸沒(méi)細(xì)胞，對(duì)照組用錫紙包住置暗處。針對(duì)試驗(yàn)分組，對(duì)需要輻射的組分別進(jìn)行UVB 造模（每天每次 10 mJ/cm2 共計(jì) 3 天連續(xù)處理）；
3） 給藥：按照各試驗(yàn)組分組，每次照射完成后進(jìn)行給藥處理培養(yǎng) 24 h，共計(jì) 3 天 3 次；
4）收樣：培養(yǎng)結(jié)束后，進(jìn)行細(xì)胞收樣，提取各實(shí)驗(yàn)組總 RNA，合成 cDNA，利用 q-PCR 檢測(cè)β-actin 和目的基因的基因表達(dá)。
5）用β-actin 作為基因表達(dá)的內(nèi)參，計(jì)算目的基因的 RNA 相對(duì)表達(dá)量。
注：本實(shí)驗(yàn)方法中的樣品的濃度因?qū)嶒?yàn)一結(jié)果而定。
【評(píng)價(jià)指標(biāo)】
衰老相關(guān)分泌表型(SASP)的表達(dá)（IL6/TNFα/MMP3。
【評(píng)價(jià)結(jié)論】
與模型對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中衰老相關(guān)分泌表型(SASP)的表達(dá)（IL6/TNFα/MMP3）顯著性下調(diào)（P＜0.05），初步證明樣品具有抗衰老功效。
【參考文獻(xiàn)】
[1]魏麗.柴達(dá)木黑果枸杞花青素對(duì) UVB 輻射體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞的衰老及 p53,p21影響的研究[D].青海大學(xué)
[2] Kulms D, Zeise E , P, Ppelmann B , et al. DNA damage, death receptor activation and reactive oxygen species contribute to ultraviolet radiation-induced apoptosis in an essential and independent way.[J]. Oncogene, 2002, 21(38): 5844-5851.
[3] 劉春顯,李南.人參皂苷 Rb1 對(duì)人體皮膚成纖維細(xì)胞衰老的影響[J].人參研究, 2022,34(4):4.
[4] 林勇, 劉碩, 朱華偉,等. 紅樹(shù)莓對(duì) UVB 誘導(dǎo) HaCaT 光損傷的抑制作用[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版), 2015, 041(005): 474-479.
[5] 馮丹, 劉婷, 李冠汝,等. 蒿秦化斑方對(duì)紫外線B誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞光損傷的影響[J]. 環(huán)球中醫(yī)藥, 2020, 13(5): 6.
（二）MMP-2 、MMP-9、TIMP-1 和 TIMP-2 的表達(dá)
【評(píng)價(jià)原理】
已有大量的研究證明，紫外線照射后誘導(dǎo)人類皮膚成纖維細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶( MMPs) 增多，MMPs 降解膠原和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，在皮膚光老化中起著重要作用。MMPs是一類含有鋅離子、活性依賴于鈣離子的蛋白酶，具有廣泛的生物學(xué)活性。已知的 MMPs 成員有 24 種，主要可分為膠原酶 ( MMP-1，8，13 ) 、基質(zhì)溶解素( MMP-3，7，10，11) 、明膠酶 ( MMP-2，9) 等亞家族，不同的 MMPs 對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)不同組分降解的特異性有所不同。人基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）是 MMPs 天然的特異性內(nèi)源性抑制劑，TIMPs 與MMPs 的精密平衡在 ECM 的合成和降解中發(fā)揮著重要作用，皮膚光老化是二者動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)的結(jié)果。因此，本研究擬用 UVB 輻射成纖維細(xì)胞以建立 UVB 所致成纖維細(xì)胞 提前衰老模型，通過(guò)樣品作用于光老化的皮膚成纖維細(xì)胞后，檢測(cè) MMP-2 、MMP-9、TIMP-1和 TIMP-2 的表達(dá)來(lái)評(píng)價(jià)樣品的抗衰老功效。
【實(shí)驗(yàn)方案】
實(shí)驗(yàn)一：MTT 法檢測(cè)樣品對(duì)成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)二：樣品對(duì) UVB 老化處理后成纖維細(xì)胞的 MMP-2 、MMP-9、TIMP-1 和TIMP-2 表達(dá)情況
1） 細(xì)胞接種：將成纖維細(xì)胞以 2 × 10^5 個(gè)/孔接種于 6 孔板，于培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中培養(yǎng) 12 h，分別設(shè)置對(duì)照組（X mJ/cm2+0 mM 樣品）、UVB 照射低濃度組（30 mJ/cm2+AmM 樣品）、UVB 照射中濃度組（30 mJ/cm2 +B mM 樣品）、UVB 照射高濃度組（30 mJ/cm2+ C mM 樣品）。
2） UVB 老化處理：UVB 輻射前成纖維細(xì)胞用 D’Hanks 洗 3 遍，在孔中加入 1 mL D’Hanks，使之浸沒(méi)細(xì)胞，對(duì)照組用錫紙包住置暗處。針對(duì)試驗(yàn)分組，對(duì)需要輻射的組分別進(jìn)行UVB 造模（每天每次 10 mJ/cm2 共計(jì) 3 天連續(xù)處理）；
3） 給藥：按照各試驗(yàn)組分組，每次照射完成后進(jìn)行給藥處理培養(yǎng) 24 h，共計(jì) 3 天 3 次；
4）收樣：培養(yǎng)結(jié)束后，進(jìn)行細(xì)胞收樣，提取各實(shí)驗(yàn)組總 RNA，合成 cDNA，利用 q-PCR 檢測(cè)β-actin 和目的基因的基因表達(dá)。
5）用β-actin 作為基因表達(dá)的內(nèi)參，計(jì)算目的基因的 RNA 相對(duì)表達(dá)量。
注：本實(shí)驗(yàn)方法中的樣品的濃度因?qū)嶒?yàn)一結(jié)果而定。
【評(píng)價(jià)指標(biāo)】
MMP-2 、MMP-9、TIMP-1 和 TIMP-2 相對(duì)表達(dá)量
【評(píng)價(jià)結(jié)論】
與模型對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中樣品對(duì)衰老細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶相關(guān)基因表達(dá)（MMP-2和 MMP-9）顯著性下調(diào)、而其抑制基因（TIMP-1 和 TIMP-2）顯著性上調(diào)（P＜0.05），初步證明樣品具有抗衰老功效。
【參考文獻(xiàn)】
[1] 殷珊.梔子黃色素對(duì)小鼠B16黑素瘤細(xì)胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素生成影響的實(shí)驗(yàn)研究[D].湖南中醫(yī)藥大學(xué).
[1]魏麗.柴達(dá)木黑果枸杞花青素對(duì) UVB 輻射體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞的衰老及 p53,p21影響的研究[D].青海大學(xué)
[2] Kulms D, Zeise E , P, Ppelmann B , et al. DNA damage, death receptor activation andreactive oxygen species contribute to ultraviolet radiation-induced apoptosis in an essential andindependent way.[J]. Oncogene, 2002, 21(38): 5844-5851.
[3] 劉春顯,李南.人參皂苷 Rb1 對(duì)人體皮膚成纖維細(xì)胞衰老的影響[J].人參研究, 2022,34(4):4.
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[5] 馮丹, 劉婷, 李冠汝,等. 蒿秦化斑方對(duì)紫外線B誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞光損傷的影響[J]. 環(huán)球中醫(yī)藥, 2020, 13(5): 6.
[6]陳巧云,王業(yè)秋,陳景華,等.桃葉珊瑚苷對(duì)光老化皮膚成纖維細(xì)胞 MMP-1 和 TIMP-1 表達(dá)的影響[J].中成藥, 2014, 36(8):5.
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