項目一：屏障修護功能相關(guān)基因表達測定
【實驗原理】
角質(zhì)形成細胞在向上分化形成皮膚屏障的過程中，各種結(jié)構(gòu)基因會不同程度地表達，翻譯出蛋白并特異性分布在皮膚的各層中。與皮膚屏障功能密切相關(guān)的蛋白主要由細胞與細胞間的緊密連接蛋白和細胞與基質(zhì)間的錨定連接蛋白有關(guān)。而上述緊密連接蛋白中主要以有閉合蛋白（occludin）、密封蛋白（claudin)、連接粘附分子（JAM) 和 閉合小環(huán)蛋白（ZOs）為主。包括板層素（Laminin）、IV型、VII及XVII膠原蛋白又是組成錨定連接蛋白組分。本實驗利用人永生化角質(zhì)形成細胞（HaCaT），將樣品作用于細胞后檢測緊密連接蛋白和錨定連接蛋白基因相對表達量，來評估樣品的屏障修護功效。
【實驗步驟】
實驗一：MTT法檢測某化妝品對HaCaT的細胞毒性實驗
1）細胞接種：接種細胞于96孔板內(nèi)（1×10^4 個/孔），于37 ℃，5% CO2中培養(yǎng)24 h。
2）給藥：樣品組加入相應濃度的含樣品的培養(yǎng)基，正常對照組更換為新鮮培養(yǎng)基，空白組加入空白培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2孵育24 h。
3）孵育結(jié)束后向每孔中加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。
4）去培養(yǎng)液，加入DMSO溶液，振蕩混勻，測定490 nm處吸光度值。
OD490：490 nm處的吸光度值
實驗二：屏障修護功能相關(guān)基因表達測定
1）細胞接種：接種HaCaT細胞于6孔板中，每孔6 × 10^5個，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h。
2）給藥：孵育結(jié)束后，D-Hanks輕柔沖洗細胞一次或兩次，正常對照組加入新鮮培養(yǎng)基，樣品組加入含相應濃度的樣品新鮮培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h。
3）收樣及檢測：培養(yǎng)結(jié)束后，進行細胞收樣，提取各實驗組總RNA，合成cDNA，利用q-PCR檢測β-actin和目的基因的基因表達。
4）數(shù)據(jù)分析：用β-actin作為基因表達的內(nèi)參，計算目的基因的RNA相對表達量。
【評價指標】屏障修護功能相關(guān)基因表達測定
【評價結(jié)論】
供試品組與對照組相比屏障修護功能相關(guān)基因表達上調(diào)且具有顯著性差異（P＜0.05），初步證明該樣品具有修護功效。
【參考結(jié)論】
[1] Anna D?bińska, Matteo Megna, New Treatments for Atopic Dermatitis Targeting Skin Barrier Repair via the Regulation of FLG Expression[J]. J Clin Med. 2021,10(11): 2506.
[2] 杜洪振, 孫欽秀, 楊振,等. 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對鯉魚肌原纖維蛋白乳化活性和凝膠特性的影響[J].食品工業(yè)科技, 2019, 40( 6) : 126-130,278.
項目二：利用細胞劃痕實驗評價供試品的皮膚屏障修復功效
【評價原理】
隨著年齡的增加，皮膚接受外來環(huán)境（物理損傷，化學試劑等）的影響，造成皮膚的日益老化，在老化的過程中，細胞的損傷逐漸積累，進一步加速了皮膚老化。人皮膚角質(zhì)形成細胞（human immortalized keratinocytes, HaCaT）是構(gòu)成皮膚表皮層的主要細胞類型，并且具有表皮構(gòu)成、創(chuàng)傷修復、細胞角化、細胞因子分泌和免疫監(jiān)視等功能，常被用于生物醫(yī)學領(lǐng)域作為體外皮膚研究的細胞系，例如皮膚修復愈合和防曬等，在傷口愈合的早期階段，表皮中角化形成細胞被激活，并遷移到創(chuàng)傷部位誘導傷口收縮，接著進行細胞增殖以皮膚修復重建。因此，角質(zhì)形成細胞對于傷口愈合有重要作用。利用人永生化角質(zhì)形成細胞HaCaT建立劃痕實驗模型，檢測供試品是否對細胞具有屏障修護的功效。
【實驗方法】
將對數(shù)生長期的HaCaT消化重懸后進行計數(shù)，接種6×10^5個細胞/孔培養(yǎng)（37℃、5%CO2、24h），分別設置空白組、陽性對照組和樣品組。待細胞100%融合后，用槍頭比著載玻片，盡量垂至于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜。劃痕結(jié)束后，用PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，對照組加入1%血清培養(yǎng)基，陽性對照組加入含100ng/ml EGF的1%血清培養(yǎng)基，實驗組加入含一定濃度受試物的1%血清培養(yǎng)基。放入37度5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。按0和24小時取樣，拍照，計算愈合率：
【評價指標】HaCaT細胞修復愈合率
【評價結(jié)果】樣品組給藥24 h后的劃痕面積與正常對照組相比，明顯減少，揭示了該樣品具有修護功效。
【參考文獻】
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