【實(shí)驗(yàn)原理】
皮膚是我們身體中最大的器官，具有各種不同的復(fù)雜功能。它由三個不同的層組成:表皮、真皮和皮下組織。表皮是皮膚的最外層，作為抵御環(huán)境損害的屏障，包括壓力、微生物和輻射。此外，表皮也作為機(jī)體保濕的重要防線，目前機(jī)體保濕程序可以分為被動保濕和主動保濕，兩者相互協(xié)調(diào)共同保障皮膚角質(zhì)層的水合程度。其中天然保濕因子（NMF）是具有吸水特性的小分子復(fù)合物，由透明質(zhì)酸和絲聚蛋白組成，能夠有效吸收并鎖住水分，配合防護(hù)角質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，強(qiáng)化鎖水屏障。而其中水通道蛋白（AQP3）表達(dá)于表皮基底層的角質(zhì)形成細(xì)胞，可以轉(zhuǎn)運(yùn)水、甘油和尿素到達(dá)表皮，促進(jìn)角質(zhì)層的水合作用，是維持皮膚水合作用的一個關(guān)鍵因素。綜上，本實(shí)驗(yàn)擬通過檢測樣品處理下角質(zhì)形成細(xì)胞中FLG和AQP3基因相對表達(dá)量以及HA含量來評價樣品否具有保濕功效。
【實(shí)驗(yàn)方法】
實(shí)驗(yàn)一：MTT法檢測樣品對HaCaT的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
1）細(xì)胞接種：接種細(xì)胞于96孔板內(nèi)（1 × 10^4個/孔），于37 ℃，5% CO2中培養(yǎng)24 h。
2）給藥：樣品組加入相應(yīng)濃度的含樣品的培養(yǎng)基，正常對照組更換為新鮮培養(yǎng)基，空白組加入空白培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2孵育24 h。
3）孵育結(jié)束后向每孔中加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。
4）去培養(yǎng)液，加入DMSO溶液，振蕩混勻，測定490 nm處吸光度值。
OD490：490 nm處的吸光度值
實(shí)驗(yàn)二：樣品處理后HaCaT的FLG和AQP3基因表達(dá)
1) 細(xì)胞接種：將HaCaT以6 × 10^5個/孔接種于6孔板，于培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中培養(yǎng)12 h，分別設(shè)置對照組（X mJ/cm2+0 mM樣品）、低濃度組（X mJ/cm2+A mM樣品）、中濃度組（X mJ/cm2+B mM樣品）、高濃度組（X mJ/cm2 + C mM樣品）。
2)給藥：各試驗(yàn)組中分別加入含有不同濃度樣品的 DMEM 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h；
3）孵育結(jié)束后，D-Hanks輕柔沖洗細(xì)胞一次或兩次，正常對照組加入新鮮培養(yǎng)基，樣品組加入含相應(yīng)濃度的樣品新鮮培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h。
4）培養(yǎng)結(jié)束后，進(jìn)行細(xì)胞收樣，提取各實(shí)驗(yàn)組總RNA，合成cDNA，利用q-PCR檢測β-actin和目的基因的基因表達(dá)。
5）用β-actin作為基因表達(dá)的內(nèi)參，計(jì)算目的基因的RNA相對表達(dá)量。
實(shí)驗(yàn)三：樣品處理后HaCaT的HA含量測定
1.細(xì)胞接種：接種細(xì)胞于12孔板內(nèi)（3 × 105 個/孔），于37 ℃，5% CO2中培養(yǎng)24 h。
2.給藥：樣品組加入相應(yīng)濃度的含樣品的培養(yǎng)基，正常對照組更換為新鮮培養(yǎng)基，空白組加入空白培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2孵育24 h。
3.收樣檢測：孵育結(jié)束后，每孔收集300 μL細(xì)胞培養(yǎng)上清，ELISA法檢測透明質(zhì)酸含量。
【評價指標(biāo)】
FLG和AQP3基因表達(dá)、HA含量
【評價結(jié)論】
與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組FLG和AQP3基因表達(dá)以及HA含量均具有顯著性上調(diào)且呈現(xiàn)劑量相關(guān)性（P＜0.05），初步證明樣品具有保濕功效。
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