編者按

 腎近端小管(PTs)是腎單位的一個(gè)高度特化的部分，執(zhí)行腎臟的大部分重吸收和分泌功能。它們的獨(dú)特作用和高代謝活性使PTs極易受到毒素和代謝應(yīng)激的影響。因此，含有高成熟度PT細(xì)胞的類(lèi)器官將成為藥物開(kāi)發(fā)、毒理學(xué)研究和PT功能障礙研究的重要工具。

近年來(lái)，通過(guò)干細(xì)胞體外培養(yǎng)產(chǎn)生的具有三維結(jié)構(gòu)的微型腎臟模型為腎臟發(fā)育、腎臟疾病致病機(jī)理研究以及腎臟再生提供了強(qiáng)大的工具，其中由多功能干細(xì)胞誘導(dǎo)成腎類(lèi)器官的技術(shù)愈發(fā)成熟，并且這些類(lèi)器官顯示出與發(fā)育中的人類(lèi)腎臟顯著的轉(zhuǎn)錄相似性，但目前誘導(dǎo)的類(lèi)器官中腎單元模式和功能分割仍然不成熟，其中PT的成熟和功能分割尤其不發(fā)達(dá)。

2022年10月8日 ，墨爾本默多克兒童研究所的Vanslambrouck Jessica M研究團(tuán)隊(duì)在Nature Communications（IF=16.6）上發(fā)表了最新研究成果，該研究開(kāi)發(fā)了一種后腎小管分化技術(shù)，用于在腎臟類(lèi)器官中模擬功能性近曲小管，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)毒性篩選和傳染病建模的應(yīng)用。PT增強(qiáng)的類(lèi)器官為研究人類(lèi)近曲小管成熟、遺傳性和獲得性近曲小管疾病及藥物和病毒反應(yīng)提供了一個(gè)精確的模型。

文章題目

Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids

雜志：Nature Communications（IF=16.6）

發(fā)表時(shí)間：2022.10.8

作者：Vanslambrouck Jessica M,Wilson Sean B,Tan Ker Sin et al.

單位：墨爾本默多克兒童研究所、澳大利亞墨爾本大學(xué)等

01、研究結(jié)果

1. 延遲腎單元誘導(dǎo)可以產(chǎn)生腎單元祖細(xì)胞

鑒于初始分化條件和時(shí)間對(duì)腎單元祖細(xì)胞存活和后續(xù)腎單元形態(tài)的明顯影響，研究人員在擴(kuò)增培養(yǎng)腎單元祖細(xì)胞群體的同時(shí)推遲對(duì)腎單元的誘導(dǎo)。

結(jié)果證明，延遲誘導(dǎo)會(huì)產(chǎn)生更多的腎單元群體，并且在化學(xué)成分確定的CDBLY2介質(zhì)參與下，所培養(yǎng)的腎單元祖細(xì)胞的分化程度和均一性更強(qiáng)，且PCR驗(yàn)證其誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞的腎相關(guān)表達(dá)基因更顯著，從而產(chǎn)生具有更好形態(tài)和 PT 增強(qiáng)的類(lèi)器官。

圖1

2. 延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間可誘導(dǎo)Six2+腎單元祖細(xì)胞衍生成為近端腎單元

先前有報(bào)道表明，體內(nèi)腎單元完全來(lái)自于SIX2+腎單元祖細(xì)胞分化而來(lái)，但在類(lèi)器官中腎單元含有來(lái)自 SIX2+的細(xì)胞，但也有來(lái)自SIX2-的細(xì)胞相互嵌合組成。

為了證實(shí)并比較腎單元祖細(xì)胞富集單層分化對(duì)腎單元形成的貢獻(xiàn)能力，研究者們使用SIX2Cre/Cre:GAPDHdual譜系追蹤線，采用標(biāo)準(zhǔn)方案和PT增強(qiáng)方案去誘導(dǎo)類(lèi)器官。使用足細(xì)胞、近端和遠(yuǎn)端小管的一系列標(biāo)記物檢測(cè)出類(lèi)器官中顯示出明顯的近端遠(yuǎn)端分割。

與標(biāo)準(zhǔn)方案產(chǎn)生的類(lèi)器官具有分支GATA3 +上皮相比，擴(kuò)展方案衍生的類(lèi)器官具有表達(dá)輸尿管上皮標(biāo)記物GATA3的少數(shù)結(jié)構(gòu)。延長(zhǎng)的培養(yǎng)方案產(chǎn)生的類(lèi)器官具有腎單元的中心環(huán)和向外輻射的細(xì)長(zhǎng)PTs，這與標(biāo)準(zhǔn)類(lèi)器官中這些結(jié)構(gòu)更均勻的分布截然相反，且PT增強(qiáng)方案誘導(dǎo)的類(lèi)器官中SIX2+ 細(xì)胞對(duì)近端腎小管的形成貢獻(xiàn)更大。

圖2

3. PT增強(qiáng)類(lèi)器官顯示近端小管成熟度有所提高

為了確定PT增強(qiáng)類(lèi)器官中近端小管的成熟程度，研究者們通過(guò)免疫熒光評(píng)估了成熟 PT 所特有具有重要功能的刷狀緣膜蛋白和標(biāo)記物的表達(dá)及細(xì)胞定位情況。

結(jié)果表明與正常類(lèi)器官相比，PT增強(qiáng)類(lèi)器官中蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體CUBILIN-MEGALIN (CUBN-MEG) 和中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體 SLC6A19高表達(dá)，且近端小管表型更成熟，刷狀邊界膜發(fā)育更理想，并且通過(guò)全轉(zhuǎn)錄組比較發(fā)現(xiàn)，PT增強(qiáng)類(lèi)器官中近端小管細(xì)胞的所占比例更高，與人體腎臟內(nèi)基因的表達(dá)有更高的一致性。

圖3 

4. 局部WNT拮抗驅(qū)動(dòng)腎元細(xì)胞的徑向排列

所有 PT 增強(qiáng)的類(lèi)器官中都觀察到了特征性的徑向圖案，其中腎小管與其腎小球朝類(lèi)器官中心排列，圍繞著中心核心區(qū)域，而遠(yuǎn)端 SLC12A1 + 區(qū)段則朝類(lèi)器官外圍排列。先前的研究不僅表明間質(zhì)/基質(zhì)群在腎單元分化中的作用，而且還表明近端-遠(yuǎn)端模式化是由沿腎單元軸的 Wnt/β-catenin 信號(hào)控制的。

較低的WNT信號(hào)可促進(jìn)近端腎元的形成和成熟，因此PT增強(qiáng)類(lèi)器官的中心核心可能擁有影響腎元模式的基質(zhì)群體或表達(dá)局部WNT拮抗劑，從而導(dǎo)致定向信號(hào)提示，同時(shí)檢測(cè)皮層基質(zhì)、軟骨前和髓質(zhì)間質(zhì)等標(biāo)志物的表達(dá)差異，表明中央核心區(qū)域可能控制WNT通路介導(dǎo)的腎元模式，進(jìn)而驅(qū)動(dòng)所觀察到的徑向排列，后續(xù)通過(guò)比對(duì)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)PT增強(qiáng)類(lèi)器官中WNT 拮抗劑 SFRP2 和前軟骨標(biāo)志物的表達(dá)明顯更高。

圖4 

5. 功能增強(qiáng)的腎元類(lèi)器官使藥物篩選成為可能

為了驗(yàn)證在PT增強(qiáng)的類(lèi)器官中，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的高表達(dá)和頂端細(xì)胞定位可以表明構(gòu)建的類(lèi)器官具有了腎元的部分功能，研究者們通過(guò)培養(yǎng)基中添加熒光標(biāo)記物，結(jié)果表明PT增強(qiáng)的類(lèi)器官中物質(zhì)運(yùn)輸?shù)墓δ苓h(yuǎn)強(qiáng)于普通類(lèi)器官，且這種行為是可以在藥物的作用下進(jìn)行調(diào)控，具有轉(zhuǎn)運(yùn)活性的特異性，相比之下，標(biāo)準(zhǔn)類(lèi)器官未顯示標(biāo)記物的攝取，表明其轉(zhuǎn)運(yùn)體功能不成熟。

在建立的 PT 增強(qiáng)類(lèi)器官中驗(yàn)證了其具有白蛋白和有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力之后，進(jìn)而評(píng)估了它們對(duì)腎毒性損傷的反應(yīng)。通過(guò)順鉑誘導(dǎo)PT增強(qiáng)類(lèi)器官和標(biāo)準(zhǔn)類(lèi)器官后獲取二者的 scRNAseq數(shù)據(jù)集，對(duì)比發(fā)現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)類(lèi)器官相比，PT增強(qiáng)型類(lèi)器官中大多數(shù)順鉑流入和流出轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)量更高，具有更高的順鉑轉(zhuǎn)運(yùn)能力，且PT增強(qiáng)類(lèi)器官中腎損傷基因的表達(dá)上均高于標(biāo)準(zhǔn)類(lèi)器官，表明PT增強(qiáng)類(lèi)器官可以作為順鉑誘導(dǎo)腎毒性的有利模型。

圖5 

6. 改進(jìn)的PTs類(lèi)器官提高了SARS-CoV-2研究的適用性

在疾病模型中，為了研究腎臟損害是由直接的病毒感染還是炎癥反應(yīng)和藥物腎毒性聯(lián)合引起的，研究者們利用改進(jìn)的PTs類(lèi)器官，研究了它們作為SARS-CoV-2感染和發(fā)病機(jī)制模型的適用性。

對(duì)多個(gè)來(lái)源的類(lèi)器官細(xì)胞scRNAseq數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，結(jié)果顯示與現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)類(lèi)器官數(shù)據(jù)集相比，近端和遠(yuǎn)端管段的SARS-CoV-2進(jìn)入因子在PT增強(qiáng)類(lèi)器官中的表達(dá)水平和豐度都顯著表達(dá)，病毒的感染性方面PT增強(qiáng)類(lèi)器官檢測(cè)到感染性病毒的時(shí)間更早且病毒表達(dá)豐度更高，并且感染后類(lèi)器官的擴(kuò)增性較現(xiàn)有的類(lèi)器官來(lái)說(shuō)有很大提高。

圖6 

02、編者點(diǎn)評(píng)

綜上，本研究開(kāi)發(fā)了一種后腎小管分化技術(shù)，用于在腎臟類(lèi)器官中模擬功能性近曲小管，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)毒性篩選和傳染病建模的應(yīng)用。

研究中通過(guò)改進(jìn)多能干細(xì)胞衍生的腎臟類(lèi)器官的分化條件，成功誘導(dǎo)形成了具有延長(zhǎng)和對(duì)齊的近曲小管段以及SLC12A1陽(yáng)性的腎單位。這種經(jīng)過(guò)PT增強(qiáng)的器官組織具有更好的白蛋白和有機(jī)陽(yáng)離子吸收能力，對(duì)順鉑有毒性反應(yīng)，SARS-CoV-2 進(jìn)入因子的表達(dá)得到改善，從而增加了病毒復(fù)制。腎單元的顯著近軸定向來(lái)自于源自類(lèi)器官基質(zhì)核心的局部 WNT 拮抗作用，因此，PT增強(qiáng)型類(lèi)器官是研究遺傳性和獲得性近端腎小管疾病以及藥物和病毒反應(yīng)的改良模型。

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