編者按

 腎臟是人體的重要器官，它的基本功能是生成尿液，借以清除體內(nèi)代謝產(chǎn)物及某些廢物、毒物，同時經(jīng)重吸收功能保留水份及其他有用物質(zhì)，如葡萄糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、碳酸氫鈉等，以調(diào)節(jié)水、電解質(zhì)平衡及維護酸堿平衡。腎臟同時還有內(nèi)分泌功能，生成腎素、促紅細胞生成素、前列腺素、激肽等，又為機體部分內(nèi)分泌激素的降解場所和腎外激素的靶器官。腎臟的這些功能，保證了機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，使新陳代謝得以正常進行。

今天，我們特別關注一項墨爾本默多克兒童研究所研究團隊于2023年9月發(fā)表在《Nature Protocols》的經(jīng)典研究——Generation of proximal tubule-enhanced kidney organoids from human pluripotent stem cells，該研究報告了一種用于生成近端小管高成熟度和功能性的腎臟類器官的方法。

文章題目

Generation of proximal tubule-enhanced kidney organoids from human pluripotent stem cells

雜志：Nature Protocols（IF=12.4）

發(fā)表時間：2023.9.28

作者：Jessica M. Vanslambrouck, Ker Sin Tan, Sophia Mah & Melissa H. Little等

單位：墨爾本默多克兒童研究所、澳大利亞墨爾本大學等

01、研究背景

人類多能干細胞（hPSCs）定向分化為腎臟類器官，生成具有被基質(zhì)和內(nèi)皮細胞包圍的節(jié)段性腎小管的類器官。但是腎小球形態(tài)仍不成熟，鑒于近端小管（PT）在腎小球重吸收和分泌中的獨特作用，以及影響著腎臟的整體功能，該結(jié)構(gòu)的不成熟尤其成問題。這種不成熟嚴重限制了腎臟類器官在藥物開發(fā)和毒理學研究以及近端小管功能障礙和疾病研究等方面的潛在應用。

在本文中，研究人員詳細的描述了一種改進hPSCs腎小球祖細胞的方案，與使用標準腎臟類器官方案生成的腎臟類器官相比，該方案可生成具有細長近端化腎小球的腎臟類器官，并顯示出更高的PT成熟度。此外還介紹了一種評估器官組織內(nèi)PT功能的方法，以及通過免疫熒光觀察成熟標志物的方法。

02、研究結(jié)果

1. PT增強型類器官方案

研究人員描述了一種PT增強型腎臟類器官的制備方法，該方法通過調(diào)整胚胎期間分化階段的持續(xù)時間和維持特定中間狀態(tài)，促進了腎母細胞的形成。具體來說，通過延長典型WNT信號誘導的時間，并在后續(xù)階段引入FGF9，使得腎母細胞的后中胚層形成更為強健。

此外，通過將單層分化階段延長至第13天，并使用腎母細胞支持培養(yǎng)基，更好地模擬了腎臟發(fā)育過程中的復雜信號環(huán)境，從而促進了腎臟類器官的形成。

原文圖1 PT增強型類器官方案示意圖

2. PT增強型腎臟類器官的形成

與先前的方法相比，該方案的單層分化階段延長，并且在第13天生成腎臟類器官。分化過程包括使用TeSR-E6和DMEM/F12基礎培養(yǎng)基，先后暴露于CHIR99021和FGF9。

從分化的第8到13天，通過添加經(jīng)過調(diào)整以增加BMP7水平的腎小球祖細胞維持培養(yǎng)基，進一步促進腎小球間充質(zhì)群體的生長。最終的腎臟類器官在第13天生成，并在第27天收集，以最大限度地延長腎臟類器官的成熟時間。

原文圖2 hPSC單層細胞和PT增強型腎臟類器官的明場圖像

3. PT增強型腎臟類器官的功能和蛋白質(zhì)表達分析

為確定腎臟類器官的形態(tài)和成熟度，在聚合后14 d時固定一部分腎臟類器官，用于PT特異性標記免疫熒光，而其余類器官則用于熒光底物攝取檢測。首先進行白蛋白攝取分析，然后進行PT特異性有機陽離子轉(zhuǎn)運分析。

使用激光掃描共聚焦顯微鏡對兩種功能測試中的正常培養(yǎng)類器官以及免疫熒光后固定的類器官進行成像。根據(jù)放射狀腎小管的存在情況，可以認為PT增強的類器官已培養(yǎng)成功，這些腎小管吸收熒光標記的白蛋白和DAPI（圖3），表達PT特異性蛋白（圖4），并在其頂端膜上結(jié)合蓮花四角凝集素（LTL）（圖4）。

原文圖3 蛋白質(zhì)吸收和有機陽離子轉(zhuǎn)運PT功能測試的實時共焦圖像

原文圖4 PT增強型類器官腎小球中蛋白質(zhì)的表達和定位

4. 該研究的應用和局限性

總的來說，本文的研究結(jié)果凸顯了PT增強型腎臟類器官模型的潛力，可用于多種應用，包括藥物篩選、藥效測試、近端小管疾病的治療方法發(fā)現(xiàn)、疾病模型建立、腎臟發(fā)育研究以及生物工程方法治療疾病。然而，PT增強型腎臟類器官仍面臨一些限制，例如整體不成熟、無法長期培養(yǎng)以實現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能的成熟、部分重要轉(zhuǎn)運體的低表達水平、向非目標細胞類型分化等。

此外，該模型可能不適用于需要更遠端腎單位段的研究方法，并且無法同時在單個分化步驟中產(chǎn)生所有腎臟細胞群，這也限制了腎單位的發(fā)育。因此，盡管PT增強型腎臟類器官在腎臟研究領域具有潛力，但仍需要進一步優(yōu)化以克服這些限制，以實現(xiàn)更廣泛的臨床和研究應用。

03、編者點評

這是一項非常值得閱讀的類器官研究，適合每一位想要開展“PT增強型腎臟類器官相關研究”的學者拜讀，文中提出了誘導分化過程中的步驟，培養(yǎng)基配比以及細胞類型的鑒定方法等。其描述的人類PT增強型腎臟類器官模型為藥物開發(fā)、毒理學研究以及近端小管功能障礙和疾病研究等開辟了道路。

作為健康美麗產(chǎn)業(yè)CRO服務開拓者與引領者、斑馬魚生物技術的全球領導者，環(huán)特生物搭建了“斑馬魚、類器官、哺乳動物、人體”四位一體的綜合技術服務體系，開展健康美麗CRO服務、科研服務、智慧實驗室搭建三大業(yè)務。目前，環(huán)特已建立200多種斑馬魚模型，胃癌、腦類器官、心臟類器官及各種腫瘤類器官培養(yǎng)平臺，歡迎有需要的讀者垂詢！