編者按

 四溴鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（TBPH），作為一種新型溴代阻燃劑，是傳統(tǒng)阻燃劑五溴聯(lián)苯醚(penta-BDEs)的替代品。作為添加型的阻燃劑，TBPH在生產(chǎn)、使用和廢棄時，不可避免地被釋放進(jìn)入環(huán)境中，對生態(tài)環(huán)境和人類健康造成潛在的威脅。已有研究表明，許多環(huán)境污染物會破壞動物體內(nèi)的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致異常的脂質(zhì)積累，主要是肝細(xì)胞中甘油三酯(TG)的積累，并伴隨肝細(xì)胞膨脹、炎癥和氧化應(yīng)激。這些不良反應(yīng)可能導(dǎo)致肝脂肪變性或從單純性脂肪肝轉(zhuǎn)變?yōu)榇x綜合征的肝臟表現(xiàn)，如非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的組織學(xué)表型。

今天，我們分享2021年5月由中國科學(xué)院水生生物研究所研究團(tuán)隊(duì)發(fā)表在《Environmental Science & Technology》（IF=11.4）的一項(xiàng)研究成果，該研究建立了斑馬魚非酒精性脂肪肝模型來驗(yàn)證暴露于TBPH是否會誘導(dǎo)NAFLD進(jìn)展及其潛在機(jī)制，并進(jìn)行生化測試、組織病理學(xué)觀察和肝臟轉(zhuǎn)錄譜分析以評估NAFLD易感性。為進(jìn)一步探索NAFLD發(fā)病機(jī)制及其潛在毒理學(xué)機(jī)制，還研究了表觀遺傳修飾(例如DNA甲基化)，研究結(jié)果表明，TBPH暴露破壞了斑馬魚的肝臟脂質(zhì)代謝并誘發(fā)了NAFLD。

文章題目

Nonalcoholic Fatty Liver Disease Development in Zebrafish upon Exposure to Bis(2-ethylhexyl)-2,3,4,5-tetrabromophthalate, a Novel Brominated Flame Retardant

雜志：Environmental Science & Technology（IF=11.4）

發(fā)表時間：2021年5月2日

作者：周炳升，楊麗華，韓建，李瑞雯等

單位：中國科學(xué)院水生生物研究所

01、研究背景

四溴鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯(TBPH)是一種新型溴化阻燃劑，是五溴聯(lián)苯醚(BDEs)等傳統(tǒng)溴化阻燃劑的替代品，已被列為高產(chǎn)量化學(xué)品。在過去十年中，它的大規(guī)模使用伴隨著廣泛的污染，導(dǎo)致在室內(nèi)灰塵、空氣、污水污泥和水生環(huán)境中檢測到它的存在。此外，據(jù)報(bào)道，TBPH在水生食物網(wǎng)中經(jīng)歷了營養(yǎng)放大，在魚類、海洋海豚和鼠海豚中檢測到高濃度在人類樣本中也檢測到它的存在，如頭發(fā)、指甲、血清和母乳。

雖然TBPH已在環(huán)境和生物體中被廣泛檢測到，但根據(jù)先前的研究，在暴露的生物體(如魚類)中，急性毒性相對較低。然而，TBPH的結(jié)構(gòu)類似于鄰苯二甲酸二(2乙基己基)鄰苯二甲酸酯，一種已知的過氧化物酶體增殖劑和脂質(zhì)代謝干擾物；因此，TBPH已被證明是過氧化物酶體增殖體激活核受體γ (ppartγ)激動劑。在我們最近對斑馬魚胚胎的研究中，我們觀察到急性暴露于TBPH誘導(dǎo)了脂質(zhì)儲存的減少，主要以依賴于pparγ的方式，通過促進(jìn)pparγ啟動子的去甲基化和激發(fā)下游參與脂質(zhì)代謝的基因轉(zhuǎn)錄。核受體信號在脂質(zhì)代謝功能障礙中起著至關(guān)重要的作用，尤其是PPAR家族。最近有報(bào)道稱，表觀遺傳調(diào)控，如DNA甲基化，通過干擾脂質(zhì)代謝在人類肥胖發(fā)展中發(fā)揮作用。我們假設(shè)TBPH破壞代謝處理器，通過PPAR信號導(dǎo)致脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)受損通路；然而，TBPH對脂質(zhì)代謝的生物學(xué)作用仍有待闡明。

據(jù)報(bào)道，許多環(huán)境污染物會破壞動物體內(nèi)的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致異常的脂質(zhì)積累，主要是肝細(xì)胞中甘油三酯(TG)的積累，并伴隨肝細(xì)胞膨脹、炎癥和氧化應(yīng)激。這些不良反應(yīng)可能導(dǎo)致肝脂肪變性或從單純性脂肪肝轉(zhuǎn)變?yōu)榇x綜合征的肝臟表現(xiàn)，如非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的組織學(xué)表型。環(huán)境污染是NAFLD發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。在動物實(shí)驗(yàn)中，越來越多的證據(jù)表明高脂肪飲食(HFD)會加重環(huán)境化學(xué)物質(zhì)引起的NAFLD。在過去的幾十年里，超重和肥胖已成為世界范圍內(nèi)普遍存在的健康威脅，并與NAFLD風(fēng)險(xiǎn)的增加密切相關(guān)。

在此，我們的目的是確定暴露于TBPH是否會誘導(dǎo)NAFLD進(jìn)展及其潛在機(jī)制。斑馬魚作為模型生物，在肝臟細(xì)胞組成、功能、信號和介導(dǎo)肝臟疾病的細(xì)胞過程方面與人類相似，使其成為研究肝臟疾病基本機(jī)制的有用系統(tǒng)。斑馬魚被喂食正常飲食(ND)或HFD，并進(jìn)行生化測試、組織病理學(xué)觀察和肝臟轉(zhuǎn)錄譜分析以評估NAFLD易感性。為了進(jìn)一步探索NAFLD發(fā)病機(jī)制的潛在毒理學(xué)機(jī)制，我們研究了表觀遺傳修飾(例如DNA甲基化)。我們的研究結(jié)果表明，TBPH暴露破壞了斑馬魚的肝臟脂質(zhì)代謝并誘發(fā)了NAFLD。

02、研究結(jié)果

1. 在2周的暴露期間，沒有觀察到一般的毒性或行為異常。在ND組和HFD組中，TBPH暴露沒有改變體重。

在ND組中，暴露于0.02 μM TBPH對HSI（Hepatosomatic index，肝體指數(shù)=肝重/體重*100）沒有影響，但暴露于2 μM TBPH時，HSI相對于溶劑對照組顯著降低。在HFD組中，與溶劑對照組相比，暴露于0.02 μM TBPH和2 μM TBPH時，HSI顯著下降。在ND和HFD組中，與溶劑對照組相比，暴露于2 μM TBPH時，肝臟TG濃度顯著增加(圖1A)。

此外，2 μM TBPH處理后，HFD組TG濃度高于ND組(圖1A)。在暴露于0.2和2 μM TBPH時，ND組肝臟組織病理學(xué)分析顯示肝臟脂肪變性和輕度球囊變性(圖1B)，而在HFD組中，發(fā)現(xiàn)明顯的球囊變性和肝臟脂肪變性明顯惡化(圖1B)。油紅O染色進(jìn)一步證實(shí)TBPH處理中脂質(zhì)積累。HFD飼喂組的脂質(zhì)染色最小，而ND和HFD聯(lián)合2 μM TBPH組的脂質(zhì)積累最嚴(yán)重，ND和HFD飼喂的日糧加0.2 μM組的脂質(zhì)積累中等(圖1C)。

圖1

2. 研究人員測量了肝臟中促炎生物標(biāo)志物的水平，如TNF-a和IL-6。在ND組中，TBPH處理完全沒有誘導(dǎo)TNF-a和IL-6，而在HFD組中，0.2 μM和2 μM TBPH處理可顯著誘導(dǎo)TNF-a和IL-6(圖2A,B)。此外，在沒有TBPH暴露的情況下，與ND組相比，HFD組的TNF-a和IL-6顯著增加(圖2A,B)。

圖2

3. 在ND組中，SOD活性在暴露于0.02或2 μM TBPH時未受影響，而CAT活性在暴露于2 μM TBPH時顯著增加(圖3A,B)。另一方面，在HFD組中，暴露于0.2 μM和2 μM TBPH時，SOD和CAT活性顯著增加(圖3A,B)。

此外，在0.2 μM和2 μM TBPH處理下，HFD組對SOD和CAT活性的誘導(dǎo)均顯著高于ND組(圖3A,B)。在ND和HFD組中，與溶劑對照相比，在0.02 μM TBPH和2 μM TBPH處理下，GSH-px活性顯著降低(圖3C)。在0.02 μM TBPH和2 μM TBPH處理下，ND組GSH濃度雖小但顯著降低，而HFD組GSH濃度顯著升高(圖3D)。暴露于0.2和2 μM TBPH時，與ND組相比，HFD組的GSH濃度更高(圖3D)。

圖3

4. 為了揭示TBPH誘導(dǎo)魚脂肪變性的機(jī)制，采用qPCR方法測定了核受體和脂質(zhì)代謝的幾個標(biāo)記物的mRNA水平。

在ND組和HFD組中，與溶劑對照組相比，TBPH處理后PPAR家族成員(包括pparaa、pparab和pparg)的轉(zhuǎn)錄均顯著上調(diào)(圖4)。在脂質(zhì)生物發(fā)生和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因方面，測定了fabp11a、acaca、fasn、lpl、hmgcra和srebf2的轉(zhuǎn)錄。在ND組中，暴露于0.2和2 μM TBPH時，fabp11a、acaca、lpl、hmgcra和srebf2的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，而fasn的轉(zhuǎn)錄保持不變(圖4)。同樣，在HFD組中，暴露于0.02 μM和2 μM TBPH時，fabp11a、acaca、fasn、hmgcra和srebf2的轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào)，而lpl的轉(zhuǎn)錄下調(diào)(圖4)。

我們還測量了脂肪酸β氧化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如pgcla、cptlaa、cptlab和apoala。在ND和HFD組中，0.2和2 μM TBPH處理后，pgcla、cptlaa、cptlab和apoala轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào)(圖4)。

圖4

5. 在ND組中，0.02 μM和2 μM TBPH處理導(dǎo)致tetl和tet2轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào)。同樣，在HFD組中，0.02 μM和2 μM TBPH處理導(dǎo)致tetl和tet2轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào)(圖5)。根據(jù)JASPAR 2020數(shù)據(jù)，pgcla啟動子上可受DNA甲基化影響的序列中有4個DNA結(jié)合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄因子，包括3個芳烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)子位點(diǎn)和1個轉(zhuǎn)錄因子AP-2 α位點(diǎn)。

此外，在所選序列中，另一個轉(zhuǎn)錄因子AP-2a結(jié)合位點(diǎn)可受DNA甲基化模式的影響(Supporting Information)。在ND和HFD組中，與溶劑對照相比，0.02 μM TBPH和2 μM TBPH處理顯著降低了pgclo啟動子的DNA甲基化比率(圖5)。

圖5

03、編者點(diǎn)評

總之，TBPH暴露會導(dǎo)致斑馬魚脂肪肝疾病的發(fā)展，并導(dǎo)致氧化應(yīng)激。TBPH暴露破壞了斑馬魚的肝脂代謝，并誘導(dǎo)了非酒精性脂肪肝疾?。∟AFLD）。TBPH暴露還導(dǎo)致DNA去甲基化，并影響肝臟轉(zhuǎn)錄組。

作為健康美麗產(chǎn)業(yè)CRO服務(wù)開拓者與引領(lǐng)者、斑馬魚生物技術(shù)的全球領(lǐng)導(dǎo)者，環(huán)特生物搭建了“斑馬魚、類器官、哺乳動物、人體”多維生物技術(shù)服務(wù)體系，開展健康美麗CRO服務(wù)、科研服務(wù)、智慧實(shí)驗(yàn)室搭建三大業(yè)務(wù)。目前，環(huán)特已建立200多種斑馬魚模型，胃癌、腦類器官、心臟類器官及各種腫瘤類器官培養(yǎng)平臺，歡迎有需要的讀者垂詢！