編者按

 準(zhǔn)確預(yù)測腫瘤擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)和治療效果對于個(gè)性化治療而言至關(guān)重要。目前，確定腫瘤侵襲性和擴(kuò)散性的診斷原則依賴于腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（TNM）分期原則。然而，N或M參數(shù)，需要直徑為一厘米或更大的病灶，通過醫(yī)學(xué)成像或活檢檢查來確定。這些評估存在診斷敏感性和特異性較差的問題，因此迫切需要更多的預(yù)測方法來評估腫瘤侵襲和擴(kuò)散。

今天，我們分享2022年2月由瑞典林雪平大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)發(fā)表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》（IF=11.4）的一項(xiàng)研究成果，該研究開發(fā)了將NSCLC PDX材料植入斑馬魚幼魚的新型穩(wěn)健方法，表現(xiàn)出優(yōu)異的植入率并準(zhǔn)確地再現(xiàn)了相應(yīng)小鼠PDX模型和患者本身對紫杉醇和厄洛替尼的反應(yīng)，可以直接從患者活檢中建立ZTX模型，而無需事先在小鼠中進(jìn)行擴(kuò)展?；赑DX模型植入的ZTX分析能夠準(zhǔn)確地概括非小細(xì)胞肺癌的藥物反應(yīng)和侵襲表型。

文章題目

Zebrafish patient-derived xenograft models predict lymph node involvement and treatment outcome in non-small cell lung cancer

雜志：Journal of Experimental & Clinical Cancer Research（IF=11.4）

發(fā)表時(shí)間：2022年2月9日

作者：Zaheer Ali, Malin Vildevall等

單位：瑞典林雪平大學(xué)（Link?ping University）等

01、研究背景

準(zhǔn)確預(yù)測腫瘤擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)和治療效果對于個(gè)性化治療而言至關(guān)重要。目前，確定腫瘤侵襲性和擴(kuò)散性的診斷原則依賴于腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（TNM）分期原則。然而，N或M參數(shù)，需要直徑為一厘米或更大的病灶，通過醫(yī)學(xué)成像或活檢檢查來確定。這些評估存在診斷敏感性和特異性較差的問題，因此迫切需要更多的預(yù)測方法來評估腫瘤侵襲和擴(kuò)散。

目前，預(yù)測腫瘤治療結(jié)果的黃金標(biāo)準(zhǔn)是使用在免疫功能低下的小鼠中生成的患者來源的異種移植（PDX）模型。該模型能更準(zhǔn)確的預(yù)測患者的反應(yīng)，且具有高度特征。因此，PDX模型已成為臨床前研究非常有價(jià)值的資源。然而，PDX模型無法準(zhǔn)確評估局部和全身轉(zhuǎn)移。因此需要采用其他方法來獲取有關(guān)腫瘤擴(kuò)散和藥物抗轉(zhuǎn)移療效的信息，并將與現(xiàn)有PDX模型相關(guān)的其他數(shù)據(jù)結(jié)合起來。

近來，斑馬魚腫瘤異種移植（ZTX）系統(tǒng)已成為腫瘤學(xué)和腫瘤生物學(xué)研究中一種強(qiáng)大的補(bǔ)充體內(nèi)系統(tǒng)。通過植入腫瘤細(xì)胞系（有時(shí)與非惡性腫瘤浸潤細(xì)胞結(jié)合來模擬腫瘤微環(huán)境）生成ZTX模型。然而，由于已建立的細(xì)胞系可能會(huì)隨著時(shí)間的推移而發(fā)生表型漂移，因此這些模型主要用于基礎(chǔ)研究或早期臨床前藥物開發(fā)。為了更好地再現(xiàn)患者特異性癌癥，ZTX模型是通過直接植入未擴(kuò)增的患者腫瘤樣本而生成的，并被證明可以準(zhǔn)確地概括相應(yīng)患者對兩種藥物治療的藥物反應(yīng)概況。

然而，用于此類測試的腫瘤活檢是新獲得的，因此尚未達(dá)到已建立的細(xì)胞系或PDX模型的特征。此外，腫瘤活檢組織很小，并且在ZTX模型中不會(huì)擴(kuò)大，因此只能用于一項(xiàng)或幾項(xiàng)研究，之后患者樣本就會(huì)被消耗掉。利用冷凍保存的PDX模型作為ZTX平臺(tái)的起始材料可能會(huì)克服這些問題，但目前缺乏將PDX和ZTX相結(jié)合的方法。此外，目前尚不清楚由此產(chǎn)生的ZTX模型將在多大程度上保留癌癥患者的重要病理生理學(xué)特征。

肺癌是所有癌癥類型中死亡率最高的。其高死亡率很大程度上是由于當(dāng)前醫(yī)療治療的效率低下，很少能使患者獲得長期緩解，再加上缺乏準(zhǔn)確判斷全身傳播風(fēng)險(xiǎn)的診斷技術(shù)。因此，為非小細(xì)胞肺癌患者開發(fā)新的藥物和診斷技術(shù)尤為重要。這導(dǎo)致了大量非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）PDX模型的產(chǎn)生，這些模型反過來又被大量使用和表征。

研究人員開發(fā)了將NSCLC PDX材料植入斑馬魚幼魚的新型穩(wěn)健方法，表現(xiàn)出優(yōu)異的植入率并準(zhǔn)確地再現(xiàn)了相應(yīng)小鼠PDX模型和患者本身對紫杉醇和厄洛替尼的反應(yīng)?？梢灾苯訌幕颊呋顧z中建立ZTX模型，而無需事先在小鼠中進(jìn)行擴(kuò)展?；赑DX模型植入的ZTX分析能夠準(zhǔn)確地概括非小細(xì)胞肺癌的藥物反應(yīng)和侵襲表型。

02、研究成果

1.  將冷凍保存的小鼠PDX模型的PDX組織植入斑馬魚幼魚

為了建立生成斑馬魚腫瘤異種移植（ZTX）模型的方法，研究人員共獲得了39個(gè)非小細(xì)胞肺癌模型。將冷凍保存的組織碎片消化，并與來自相同模型的冷凍保存的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行對比。分別消化或解凍后，用熒光染料DiI標(biāo)記細(xì)胞，測定其活力，最后將標(biāo)記的細(xì)胞皮下植入2 dpf斑馬魚幼魚的卵周間隙（圖1A）。在植入后和3天后分別拍攝圖像，并確定腫瘤大小的相對變化（圖1B和C）。研究人員發(fā)現(xiàn)，與先消化組織，冷凍保存為細(xì)胞懸浮液然后解凍相比，來自冷凍保存的組織碎片的細(xì)胞在解凍后分解，產(chǎn)生的腫瘤存活率更高（圖1C）。與細(xì)胞懸浮液組相比，組織碎片組中的腫瘤相對于植入時(shí)平均增大了2.2倍。因此，研究人員決定在以后的所有實(shí)驗(yàn)中使用解凍后分解的冷凍保存的組織碎片。

接下來，對斑馬魚幼魚的植入效率進(jìn)行評估。在30個(gè)模型中，有25個(gè)模型植入成功（n >20）。植入的25個(gè)模型在3 dpi時(shí)產(chǎn)生的腫瘤平均為植入時(shí)大小的64%（圖1D），這表明在3天的生長期內(nèi)，腫瘤細(xì)胞死亡在很大程度上被腫瘤增殖所平衡。有趣的是，對于大多數(shù)測試模型而言，3 dpi時(shí)的相對腫瘤大小與植入前的細(xì)胞活力無關(guān)，但產(chǎn)生高度增殖腫瘤的三個(gè)模型的相對腫瘤大?。ㄏ鄬Υ笮　?00%）確實(shí)表現(xiàn)出在植入前具有較高細(xì)胞活力的模型中更強(qiáng)勁生長的趨勢（圖1E）。同樣，相對腫瘤大小也與可從樣品中提取的細(xì)胞數(shù)量無關(guān)（圖1F）。

為了確定ZTX平臺(tái)的穩(wěn)健性，由不同的研究人員使用單獨(dú)的冷凍保存組織碎片重新運(yùn)行11個(gè)模型，并在不同的日子解凍和處理。發(fā)現(xiàn)第一次和第二次運(yùn)行之間ZTX腫瘤的發(fā)育總體上沒有差異（圖1G），這表明ZTX平臺(tái)是穩(wěn)定的。

研究人員還評估了所有30個(gè)模型中小鼠腫瘤發(fā)生和生長的兩個(gè)重要參數(shù)，即腫瘤倍增時(shí)間和生長速度，并將其與相應(yīng)ZTX模型的生長情況進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，與ZTX模型類似，小鼠PDX模型表現(xiàn)出不同的生長和攝取率（圖1H和I），但與相應(yīng)ZTX腫瘤的相對生長相關(guān)性較差。這是由于一些腫瘤具有高基質(zhì)含量，并且與腫瘤細(xì)胞相比，非惡性基質(zhì)細(xì)胞的增殖能力較低，因此在植入后的幾天內(nèi)對腫瘤生長的貢獻(xiàn)較小。同樣，雖然模型中的基質(zhì)含量在4%到30%之間變化，但這與3 dpi時(shí)ZTX腫瘤的相對大小無關(guān)（圖1J）。

圖1

2.  使用ZTX模型可準(zhǔn)確重現(xiàn)對標(biāo)準(zhǔn)治療藥物的治療反應(yīng)

研究人員對ZTX平臺(tái)中25個(gè)模型的初始隊(duì)列的藥物敏感性和耐藥性概況進(jìn)行研究，并將其與小鼠PDX模型的相應(yīng)概況進(jìn)行比較。在腫瘤植入后將斑馬魚培養(yǎng)在紫杉醇和厄洛替尼溶液中3天（圖2A）。紫杉醇和厄洛替尼的臨床相關(guān)劑量分別為20 mg/kg和10 mg/kg，正常斑馬魚在紫杉醇和厄洛替尼在該濃度下均具有耐受性（圖2B、C）。

接下來，用厄洛替尼或紫杉醇處理25個(gè)模型中每個(gè)模型的20尾腫瘤幼魚，并評估每組在0 dpi與3 dpi時(shí)的相對腫瘤大小。將藥物治療組中腫瘤的相對大小與對照組中腫瘤的相對大小進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，得出了模型的相對藥物誘導(dǎo)回歸的測量值（圖2D和E）。厄洛替尼和紫杉醇分別在25個(gè)模型中的14個(gè)和20個(gè)中有效地引起原發(fā)性腫瘤消退（圖2D和E）。

這些結(jié)果反映了與厄洛替尼相比紫杉醇的作用機(jī)制更廣泛，同時(shí)也證明了不同PDX模型對標(biāo)準(zhǔn)治療的個(gè)體反應(yīng)存在高度差異。隨機(jī)選擇15個(gè)模型，并分別確定了其小鼠對厄洛替尼和紫杉醇的藥物反應(yīng)特征。結(jié)果表明，厄洛替尼和紫杉醇抑制小鼠腫瘤生長的效力不同，從完全抑制到73.7%抑制（圖2F和G）。

重要的是，這些藥物在ZTX模型中的功效與其在小鼠PDX模型中的腫瘤生長抑制功效密切相關(guān)（圖2F和G）?？傮w而言，ZTX平臺(tái)能準(zhǔn)確再現(xiàn)對非小細(xì)胞肺癌PDX模型對標(biāo)準(zhǔn)治療的反應(yīng)。

圖2

3.  紫杉醇或厄洛替尼的療效可能是由表觀遺傳學(xué)而非基因決定

接下來，為了研究某些基因突變或基因表達(dá)水平的變化是否可以預(yù)測對厄洛替尼或紫杉醇的反應(yīng)與耐藥性，研究人員分析了與癌癥生物學(xué)和病理學(xué)相關(guān)的37個(gè)常見基因的突變譜和表達(dá)水平（圖3A-C）。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)模型中分析的大多數(shù)基因都是野生型，但tp53除外，它在27個(gè)模型中有21個(gè)發(fā)生突變。然而，由于覆蓋率較低，某些基因僅進(jìn)行了部分分析，因此在某些模型中的突變狀態(tài)尚未確定。將與27個(gè)模型的基因突變譜與藥物反應(yīng)譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)無論是厄洛替尼還是紫杉醇，都沒有明確的基因突變模式賦予其敏感性或耐藥性（圖3A）。

研究人員通過RNA測序進(jìn)一步檢查了該組中另外36個(gè)基因的表達(dá)水平（圖3B和C）以比較敏感模型和耐藥模型中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)P53抑制因子Mdm2、音Patched1和mTOR抑制劑TSC1的過度表達(dá)與厄洛替尼耐藥相關(guān)（圖3B）。類似地，Patched1和NRAS的過表達(dá)與紫杉醇耐藥性相關(guān)，而ERBB2和FOX-A的過表達(dá)與紫杉醇反應(yīng)顯著相關(guān)（圖3C）。

這些結(jié)果表明，Patched1的高表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致肺癌患者對一線治療產(chǎn)生耐藥性，這一假設(shè)應(yīng)在未來的臨床研究中進(jìn)一步研究。

圖3

4. 藥物誘導(dǎo)的腫瘤擴(kuò)散抑制與腫瘤療效無關(guān)

ZTX模型的主要優(yōu)點(diǎn)之一是可以評估早期腫瘤侵襲和擴(kuò)散。為了研究ZTX平臺(tái)是否也可以使用PDX模型確定患者腫瘤的侵襲性和擴(kuò)散性，研究人員將最初的25個(gè)可植入PDX模型中生成的細(xì)胞植入斑馬魚幼魚。在3 dpi時(shí)評估尾部造血叢主要轉(zhuǎn)移灶中出現(xiàn)的標(biāo)記腫瘤細(xì)胞數(shù)量（圖4A-C）。

結(jié)果表明，這些模型在ZTX系統(tǒng)中表現(xiàn)出高度異質(zhì)性的轉(zhuǎn)移能力（圖4C）。雖然模型的EMT評分和基質(zhì)含量與斑馬魚中接種的轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)量無關(guān)（圖3D和E），但PDX模型在植入斑馬魚幼魚之前的較高血管化程度明顯與轉(zhuǎn)移細(xì)胞的增加接種有關(guān)（圖4F），這表明與EMT評分或基質(zhì)含量相比，模型的血管生成特性與其轉(zhuǎn)移擴(kuò)散更密切相關(guān)。

接下來，研究人員通過評估每種植入模型治療后的轉(zhuǎn)移反應(yīng)來評估厄洛替尼和紫杉醇的抗轉(zhuǎn)移功效。雖然這些治療在某些模型中抑制了轉(zhuǎn)移擴(kuò)散（圖4B和G），但在測試的26個(gè)模型中的大多數(shù)模型中，它們在這方面無效。

為了評估抗轉(zhuǎn)移功效是否與藥物在ZTX平臺(tái)中引起原發(fā)性腫瘤消退的能力相關(guān)，繪制了載體組中腫瘤大小的變化與轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系（圖4H）以及厄洛替尼或紫杉醇治療模型的抗腫瘤功效與抗播散功效的對比（圖4I和J）。結(jié)果表明，腫瘤生長和轉(zhuǎn)移率之間不存在相關(guān)性（圖4H）。

然而，令人驚訝的是，對于兩種測試藥物中的任何一種，藥物誘導(dǎo)的腫瘤消退的效力與藥物誘導(dǎo)的腫瘤擴(kuò)散抑制的效力并沒有密切相關(guān)（圖4I和J），盡管這種相關(guān)性的趨勢可能會(huì)增加。從厄洛替尼治療的模型中可以看出（圖4I）。這表明EGFR阻斷可能在更大程度上抑制敏感模型中的腫瘤生長和擴(kuò)散，而在紫杉醇治療的模型中對腫瘤生長和擴(kuò)散的影響似乎彼此不相關(guān)。

圖4

5. ZTX模型中的腫瘤擴(kuò)散可高度預(yù)測患者體內(nèi)的腫瘤擴(kuò)散情況

接下來研究了ZTX模型在多大程度上重現(xiàn)了該模型所源自的患者的侵襲性腫瘤表型。在初始研究中使用的30個(gè)模型中，12個(gè)來自LN-的患者，16個(gè)來自LN+的患者。其余兩名患者缺乏此類信息（圖5A）。

在植入斑馬魚幼魚的25個(gè)模型中，15個(gè)來自LN+患者，9個(gè)來自LN-患者，其中一個(gè)來自淋巴結(jié)狀態(tài)未知的患者。有趣的是，與源自LN-患者的模型相比，源自LN+患者的PDX模型在ZTX平臺(tái)中移植的轉(zhuǎn)移細(xì)胞平均多出2.1倍（圖5B和C）。在ZTX平臺(tái)中接種5個(gè)或更多轉(zhuǎn)移細(xì)胞的七個(gè)模型均源自LN+患者，這意味著在此臨界值下可以以100%的靈敏度積極預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（圖5C和D）。

此外，在接種少于5個(gè)轉(zhuǎn)移細(xì)胞的17個(gè)模型中，有9個(gè)來自LN-患者，導(dǎo)致在此臨界值下的診斷特異性為53%。為了進(jìn)行比較，最佳臨床標(biāo)準(zhǔn)，即腫瘤（T）分期，與該患者隊(duì)列中的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（圖5E）。其他但在所有病例中較弱的淋巴結(jié)受累指標(biāo)包括與腺癌或鱗狀細(xì)胞癌相比被診斷為大細(xì)胞癌的患者（圖5F）以及具有中度或低分化腫瘤的患者（圖5G），診斷時(shí)年齡較?。▓D5H）且為女性（圖5I）。

然而，與LN-患者相比，小鼠PDX模型的侵襲特征，包括基質(zhì)含量、血管分布和EMT評分，在LN+患者中沒有顯著差異（圖5J和L）。綜合起來，這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈表明，由冷凍保存的PDX材料生成的ZTX模型能夠密切再現(xiàn)患者腫瘤的侵襲性表型，并以比當(dāng)前臨床金標(biāo)準(zhǔn)更高的靈敏度預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

圖5

6. ZTX模型的藥物反應(yīng)可高度預(yù)測患者的藥物反應(yīng)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證30個(gè)PDX模型的初始隊(duì)列中的研究結(jié)果，并進(jìn)一步比較ZTX模型中的治療結(jié)果與在患者中觀察到的結(jié)果，研究人員獲得了9個(gè)PDX模型（圖6A-C），其中患者的治療結(jié)果是已知的，這些模型對厄洛替尼和紫杉醇表現(xiàn)出不同的反應(yīng)。

五個(gè)模型源自厄洛替尼治療后復(fù)發(fā)的患者，另外三個(gè)模型來自紫杉醇治療后復(fù)發(fā)的患者（均未獲得緩解）。這八個(gè)模型對ZTX平臺(tái)中的厄洛替尼和紫杉醇具有類似的耐藥性，從而證明ZTX與患者治療結(jié)果之間具有100%的相關(guān)性（圖6A和B）。只有一個(gè)來自局部癌癥患者，該模型在ZTX模型中表現(xiàn)出低于臨界值的擴(kuò)散。在源自患有已知轉(zhuǎn)移性疾病的患者的四種模型中，三種表現(xiàn)出高于臨界值的擴(kuò)散，而一種則沒有（圖6C）。因此，在PDX模型的驗(yàn)證中，ZTX系統(tǒng)中的正確預(yù)測患者的轉(zhuǎn)移性的準(zhǔn)確度為80%。

圖6

7. ZTX模型可以直接從NSCLC患者活檢中建立

接下來，為了確定是否可以將新鮮收集的非擴(kuò)展NSCLC患者活檢組織植入斑馬魚胚胎中，研究人員開展了一項(xiàng)臨床概念驗(yàn)證研究，招募了四名患者。其中三名患者被診斷患有腺癌，而一名患者被診斷患有鱗狀細(xì)胞癌（圖6D）。所有四名患者樣本均植入斑馬魚胚胎中，盡管植入后3天時(shí)腫瘤的相對大小略低于使用PDX模型時(shí)的大?。▓D6E）。

所有ZTX模型均表現(xiàn)出高于臨界值的擴(kuò)散，這表明患者可能患有淋巴結(jié)陽性或轉(zhuǎn)移性疾病。不幸的是，所有四種ZTX模型也對厄洛替尼和紫杉醇均具有耐藥性，這表明患者可能無法從這些治療中獲得治療益處。雖然需要進(jìn)行更大規(guī)模的前瞻性研究來確定基于直接使用腫瘤活檢建立 ZTX模型來預(yù)測NSCLC患者治療結(jié)果和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的準(zhǔn)確性，但這項(xiàng)概念驗(yàn)證研究證明了這種方法的可行性方法。

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