編者按

 心血管疾病已成為人類主要死亡原因，先天性心臟缺陷是最常見的人類先天缺陷，但在創(chuàng)建用于心血管疾病和先天性心臟病研究的類器官模型方面取得的進(jìn)展明顯落后于其他器官（例如腎臟、結(jié)腸、腸、腦）。因此，現(xiàn)在迫切需要一種更接近于真實(shí)人類心臟的體外模型，使我們能夠更好地研究并進(jìn)行轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

今天，我們特別關(guān)注一項(xiàng)2021年8月由美國密歇根州立大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)在Nature Communications（IF=14.7）上發(fā)表的研究成果，該研究建立了一種使用人類多能干細(xì)胞通過自組裝生成與發(fā)育相關(guān)的人類心臟類器官的方法，并將該心臟類器官用于孕前糖尿病誘發(fā)的先天性心臟病建模，為人類先天性心臟病分子病理模型提供了一種新方案。

文章題目

Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiacdevelopment and congenital heart disease

雜志：Nature Communications（IF=14.7）

發(fā)表時間：2021.8

作者：Aitor Aguirre等

單位：美國密歇根州立大學(xué)等

01、研究結(jié)果

1. Wnt信號調(diào)節(jié)產(chǎn)生自組裝的人心臟類器官

研究人員發(fā)現(xiàn)第一次Wnt激活的最佳條件對于成功的心臟類器官形成至關(guān)重要。在第0天暴露于不同濃度的CHIR99021（1μM、2μM、4μM、6.6μM和8μM）中24小時，然后在分化第15天通過共聚焦顯微鏡評估hHOs的心臟譜系形成。所有人類胚胎干細(xì)胞（hESC）和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSC）的最佳心源性中胚層誘導(dǎo)是在1-4μM CHIR99021濃度下，而不是單層方法報道的典型的10-12μM范圍。研究人員認(rèn)為在較低的CHIR濃度下，分化的增強(qiáng)可歸因于內(nèi)源性形態(tài)素的產(chǎn)生，分化第0天至第19天之間RNA測序分析通過揭示基本心臟發(fā)育形態(tài)因子和生長因子及其各自受體的逐步產(chǎn)生支持了這一假設(shè)。

為了增加類器官復(fù)雜性并產(chǎn)生更多與發(fā)育相關(guān)的結(jié)構(gòu)，研究人員開發(fā)了一種在分化第7-9天基于第二次Wnt激活步驟誘導(dǎo)心外膜前器官分化的方法。通過測試不同濃度（2、4、6和8μM）和暴露時間（1、2、12、24、24和48 h），確定了CHIR99021激活第二次Wnt的條件。

在第15天通過心外膜成像和心外膜（WT1（TNNT2）標(biāo)記物的定量評估心外膜細(xì)胞和心肌細(xì)胞形成的效率，發(fā)現(xiàn)該處理顯著促進(jìn)了心外膜前細(xì)胞和心外膜細(xì)胞的形成。

圖1

2. 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示hHOs密切接近人類胎兒心臟發(fā)育，并產(chǎn)生所有主要的心臟細(xì)胞譜系

為了描述hHOs細(xì)胞群的發(fā)育步驟和分子特征，研究人員在整個hHO形成過程中進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。在分化的不同時間點(diǎn)（第0天至第19天）收集hHOs進(jìn)行rna測序。無監(jiān)督K-means聚類分析顯示類器官進(jìn)展了三個主要發(fā)育階段：第0天第1天，與多能性和早期中胚層承諾相關(guān)；第3天，與早期心臟發(fā)育相關(guān)；第9天第19天，與胎兒心臟成熟相關(guān)。

為了比較hHOs的心臟發(fā)育與先前現(xiàn)有方法的心臟發(fā)育，研究人員使用先前建立的方案對單層iPSC衍生的心臟分化細(xì)胞進(jìn)行了RNA測序。將RNA-seq結(jié)果與之前報道的單層心臟分化協(xié)議和人類胎兒心臟組織（胎齡57-67天）（“GSE106690”）的公開數(shù)據(jù)集進(jìn)行了比較。在所有情況下，調(diào)節(jié)第一和第二心臟場規(guī)范的hHO心臟發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)（分別為FHF，SHF）與在單層psc來源的心臟分化中觀察到的相似，并與在胎兒心臟組織中觀察到的一致?；虮磉_(dá)譜顯示，與經(jīng)歷單層分化的細(xì)胞相比，hho具有更高的心肌細(xì)胞譜系復(fù)雜性，特別是在心外膜、內(nèi)皮、心內(nèi)膜和心臟成纖維細(xì)胞群體中。這些數(shù)據(jù)表明，hHOs的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞復(fù)雜性顯著富集，從而使其與胎兒心臟一致。

圖2

3. 心臟類器官產(chǎn)生多種心臟特異性細(xì)胞譜系

轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果（圖2）表明，第二次CHIR99021暴露導(dǎo)致其他間充質(zhì)譜系的形成，由于誘導(dǎo)心外膜前器官的形成，hHOs的復(fù)雜性更高。為了評估這一發(fā)現(xiàn)，研究人員對繼發(fā)性心臟細(xì)胞譜系進(jìn)行了免疫熒光分析。共聚焦成像證實(shí)存在THY1和VIM陽性的心臟成纖維細(xì)胞（圖3a），與胎兒心臟的組成相似。對心內(nèi)膜標(biāo)記物NFATC1的免疫熒光分析顯示，心內(nèi)膜層的形成（圖3b）。

進(jìn)一步成像顯示，在第11天和第13天之間，內(nèi)皮細(xì)胞（PECAM1 +）形成一個強(qiáng)大的互聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，形成血管狀結(jié)構(gòu)。高倍圖像顯示心肌組織附近或嵌入一個復(fù)雜的內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)。這些結(jié)果強(qiáng)烈表明，在hHO發(fā)育過程中，內(nèi)皮血管結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，為類器官增加了一個血管網(wǎng)絡(luò)。

圖3

4. 人類心臟類器官再現(xiàn)了心臟場的發(fā)育和房室的規(guī)范

第一和第二心臟場（FHF，SHF）是在發(fā)育中的心臟中發(fā)現(xiàn)的兩個細(xì)胞群，在心臟發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用。第7天hHO冷凍切片的免疫熒光顯示，F(xiàn)HF和SHF祖細(xì)胞都存在并分離到各自的心臟區(qū)域。

在人類心臟中，左心室最終由FHF祖細(xì)胞形成，而心房則由SHF祖細(xì)胞形成，因此，研究人員試圖確定我們的hho是否包含屬于心房或心室譜系的心肌細(xì)胞。在第15天的hHOs中，MYL2（編碼肌凝蛋白輕鏈-2，心室亞型）和MYL7（編碼肌凝蛋白輕鏈-7，心房亞型）的免疫熒光顯示，這兩種亞型的心肌細(xì)胞均呈陽性。這兩個不同的群體定位于類器官的不同區(qū)域，并且很接近，這反映了人類心臟的表達(dá)模式。通過RNA-seq在整個分化方案中也觀察到HAND1、HAND2和MYL7轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明，hho的分化包括心臟場形成、房室規(guī)范和心室形成。

圖4

5. BMP4和Activin A改善心臟類器官腔的形成和血管形成

研究人員嘗試了BMP4和Activin A的分別在1.25 ng/ml和1 ng/ml，與4μM CHIR99021一起作用24小時。對照組和治療組hHOs之間的心?。═NNT2+）或心外膜（WT1+/TJP1+）組織的形成無顯著差異（圖5a）。

然而，當(dāng)經(jīng)生長因子處理的hHOs的直徑約大15%，這種差異可能與腔室連通性的增加相對應(yīng)，因?yàn)锽MP4/Activin A處理的hHOs具有內(nèi)部腔室樣腔，與對照hHOs相比，與其他腔室的連通性增加了50%（圖5d，e）。用BMP4和Activin A處理的類器官的免疫熒光分析顯示，PECAM1+細(xì)胞也增加了160%，表明對類器官血管化有顯著影響（圖5f，g）。這些結(jié)果表明，在BMP4/ActA下發(fā)育的類器官結(jié)構(gòu)組織得到改善。

圖5

6. 心臟類器官具有發(fā)育中的人類心臟的功能和結(jié)構(gòu)特征

傳統(tǒng)的成像方法，如共聚焦成像，不適合研究hho中復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)。因此，我們使用了光學(xué)相干斷層掃描（OCT），使用微創(chuàng)的方法來表征腔室的特性，從而保留了腔室的物理和形態(tài)特性。OCT顯示第15天hho內(nèi)清晰的腔室空間。內(nèi)部hHO拓?fù)涞娜S重建顯示這些腔室之間高度互聯(lián)，顯示靠近器官中心的4-6個腔室顯，范圍從5.5e?4mm3到1.3e?2mm3。

圖6

02、編者點(diǎn)評

總體而言，本研究構(gòu)建出了一種使用人類多能干細(xì)胞自組裝生成與發(fā)育相關(guān)的人類心臟類器官的方法，該類器官通過使用化學(xué)抑制劑和生長因子的三步Wnt信號調(diào)節(jié)策略生成，在轉(zhuǎn)錄組學(xué)、結(jié)構(gòu)和細(xì)胞水平上與人類胎兒心臟組織一致，并呈現(xiàn)多細(xì)胞類型和形態(tài)復(fù)雜性，包括了發(fā)育過程中腔室形成、電生理活動和血管化；作者團(tuán)隊(duì)還將該心臟類器官用于對孕前糖尿病誘發(fā)的先天性心臟病進(jìn)行建模，因此可能成為未來研究人類先天性心臟病分子病理學(xué)的有利模型。

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