編者按

近年來，乳酸化（Lactylation）作為一種新型蛋白質(zhì)翻譯后的修飾方式，在細(xì)胞代謝、基因表達(dá)、疾病發(fā)展、蛋白質(zhì)功能、腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮著重要作用，通過斑馬魚、基因編輯等技術(shù)深入研究乳酸化修飾的機(jī)制和功能，有望為疾病的治療和藥物研發(fā)提供新的思路和方法。

9月25日，浙江大學(xué)張龍教授研究團(tuán)隊(duì)發(fā)表在Nature雜志上最新研究揭示了乳酸化修飾調(diào)控先天性免疫新機(jī)制。無獨(dú)有偶，越來越多的研究者利用斑馬魚在乳酸化研究中取得了顯著進(jìn)展，本期我們分享近期發(fā)表的幾篇基于斑馬魚模型開展乳酸化作用機(jī)制研究的高分成果~~~

01、利用斑馬魚等揭示乳酸化驅(qū)動(dòng)的FTO靶向CDK2加重糖尿病視網(wǎng)膜病變微血管異常

文章題目

Lactylation-driven FTO targets CDK2 to aggravate microvascular anomalies in diabetic retinopathy

雜志：EMBO Molecular Medicine（IF=11.1，一區(qū)）

發(fā)表時(shí)間：2024年1月31日

作者：劉慶淮、陳雪等

單位：南京醫(yī)科大學(xué)等

文章主題：

糖尿病視網(wǎng)膜病變( diabetic retinopathy，DR )是工作年齡人群不可逆視力喪失的主要原因。肥胖相關(guān)蛋白（FTO）是一種N6-甲基腺苷（m6A）去甲基化酶，可使參與能量穩(wěn)態(tài)的RNA去甲基化，但其對(duì)DR的影響尚未深入研究。

本研究中，增殖性DR患者的玻璃體纖維血管膜中FTO表達(dá)升高，F(xiàn)TO可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞( endothelial cells，ECs )的細(xì)胞周期進(jìn)程和尖端細(xì)胞形成，從而在斑馬魚、小鼠體內(nèi)促進(jìn)血管生成；也可以通過調(diào)節(jié)EC-周細(xì)胞的相互作用，觸發(fā)糖尿病微血管滲漏，并介導(dǎo)EC-小膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用，在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)視網(wǎng)膜炎癥和神經(jīng)退行性變。

在機(jī)制上，F(xiàn)TO通過m6A-YTHDF2依賴性方式調(diào)節(jié)CDK2 mRNA的穩(wěn)定性，進(jìn)而影響內(nèi)皮細(xì)胞特性。糖尿病條件下，F(xiàn)TO上調(diào)是由乳酸介導(dǎo)的組蛋白乳酸化驅(qū)動(dòng)的。FB23-2是FTO m6A去甲基化酶活性抑制劑，可抑制體外血管生成表型。為實(shí)現(xiàn)全身給藥，研究人員開發(fā)了一種封裝FB23-2的納米平臺(tái)，并證實(shí)其在小鼠體內(nèi)的靶向性和治療效率。綜上所述，本研究表明FTO對(duì)DR中的內(nèi)皮細(xì)胞功能和視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，并可作為DR患者的治療靶點(diǎn)開展進(jìn)一步研究。

圖1 

在斑馬魚模型中，研究人員分析了FTO對(duì)血管功能的調(diào)節(jié)作用。在活的轉(zhuǎn)基因斑馬魚株Tg(LR57:GFP)中，通過胚胎注射斑馬魚FTO mRNA過表達(dá)FTO，該菌株含有增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(EGFP) cDNA，在fli1啟動(dòng)子的控制下，從而使研究人員能夠可視化其全身血管，包括眼部血管。注射濃度為120 ng/μL的FTO mRNA的斑馬魚胚胎沒有出現(xiàn)明顯的全身變化，在受精后48 h收集并檢查(圖1H, 1)。

為了研究FTO在糖尿病條件下的作用，在添加3%葡萄糖的水中培養(yǎng)魚。熒光染色檢測(cè)到，與未注射3%葡萄糖水的斑馬魚和對(duì)照組相比，注射FTO mRNA并在3%葡萄糖水中維持的斑馬魚的密度增強(qiáng)，眼部血管擴(kuò)張(圖3J)。這些數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)TO促進(jìn)糖尿病條件下斑馬魚的眼部血管化?？偟膩碚f，研究人員發(fā)現(xiàn)FTO調(diào)節(jié)內(nèi)皮尖端細(xì)胞的形成，促進(jìn)斑馬魚的新血管形成。

圖2

02、利用斑馬魚揭示PKM2乳酸化修飾代謝調(diào)控機(jī)制

文章題目

Lactylation of PKM2 Suppresses Inflammatory Metabolic Adaptation in Pro-inflammatory Macrophages

雜志：International Journal of Biological Sciences (IF=10.7)

發(fā)表時(shí)間：2022;18(16):6210-6225.

作者：章雄、劉琰等

單位：上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院等

文章主題：

乳酸是重要的表觀遺傳調(diào)控分子，它可以通過組蛋白乳酸化修飾作用，調(diào)控巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因的表達(dá)。最新證據(jù)表明，代謝適應(yīng)是巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變的重要標(biāo)志和先決條件。PKM2作為骨髓來源的巨噬細(xì)胞 (BMDM) 的主要丙酮酸激酶亞型，其調(diào)節(jié)糖酵解過程和乳酸產(chǎn)生機(jī)制研究尚不清楚。

本研究中，研究人員利用斑馬魚等首次發(fā)現(xiàn)PKM2是乳酸化修飾的底物之一，揭示了乳酸介導(dǎo)的PKM2乳酸化修飾可增加PKM2的丙酮酸激酶活性以抑制Warburg效應(yīng)，最終促進(jìn)巨噬細(xì)胞從促炎表型向修復(fù)表型的轉(zhuǎn)變，闡明了PKM2的乳酸化修飾在調(diào)節(jié)促炎巨噬細(xì)胞炎癥代謝適應(yīng)中的潛在作用。

為了探究乳酸激活PKM2的機(jī)制，研究人員在LPS誘導(dǎo)的BMDM細(xì)胞模型中，用PKM2抗體進(jìn)行IP實(shí)驗(yàn)，并使用乳酸化泛抗體檢測(cè)PKM2的乳酸化水平，發(fā)現(xiàn)乳酸處理上調(diào)了PKM2的乳酸化水平，隨后通過IP-質(zhì)譜分析找到了四個(gè)PKM2的乳酸化修飾位點(diǎn) (K62，K188，K224和K337)，其中K62R位點(diǎn)突變顯著降低了PKM2乳酸化水平，其余3個(gè)位點(diǎn)突變對(duì)乳酸化水平無顯著改變，這表明K62位點(diǎn)是PKM2的主要乳酸化位點(diǎn)，且K62位點(diǎn)在斑馬魚和許多哺乳動(dòng)物中進(jìn)化保守。因此，乳酸通過介導(dǎo)PKM2 K62位點(diǎn)的乳酸化水平增加其丙酮酸激酶活性，進(jìn)而促進(jìn)巨噬細(xì)胞向修復(fù)表型的轉(zhuǎn)變。

圖1 

03、利用斑馬魚等揭示二甲雙胍以H3K18乳酸化減少中性粒細(xì)胞募集

文章題目

Metformin Attenuates Neutrophil Recruitment through the H3K18 Lactylation/Reactive Oxygen Species Pathway in Zebrafish

雜志：Antioxidants (IF=7.6)

發(fā)表時(shí)間：2024年1月30日

作者：任大龍、殷宗俊等

單位：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院等

文章主題：

二甲雙胍(Metformin, Met)，作為一種眾所周知的的口服降糖藥，不僅能降低胰島素抵抗和肝臟葡萄糖的產(chǎn)生，還能調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，抑制巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及NF-κB信號(hào)通路，而且，對(duì)促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的增殖、調(diào)節(jié)過度活躍的免疫反應(yīng)至關(guān)重要，但二甲雙胍對(duì)中性粒細(xì)胞炎癥行為的具體影響尚不清楚。

本研究中，利用斑馬魚炎癥模型，探究了二甲雙胍對(duì)中性粒細(xì)胞募集的影響及其潛在機(jī)制，強(qiáng)調(diào)了表觀遺傳調(diào)節(jié)在炎癥中的關(guān)鍵作用，揭示了二甲雙胍在治療炎癥相關(guān)疾病方面的潛力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乳酸通過提高活性氧的水平來影響中性粒細(xì)胞的遷移，二甲雙胍降低組蛋白(H3K18)乳酸化引起的氧化應(yīng)激和炎癥，為乳酸鹽在免疫調(diào)節(jié)和炎癥中的作用提供了重要的見解。

為了探究二甲雙胍下調(diào)H3K18乳酸化，研究人員在斑馬魚實(shí)驗(yàn)中對(duì)二甲雙胍的功能進(jìn)行了深入研究，特別是在調(diào)節(jié)細(xì)胞乳酸生成中的作用，并驗(yàn)證了乳酸含量和基因表達(dá)，如hdac3，pkma, gapdh等。結(jié)果表明，經(jīng)二甲雙胍處理后，乳酸濃度顯著降低( 圖1a)，表明二甲雙胍對(duì)乳酸水平有調(diào)節(jié)作用；并觀察到hdac3、pkma和gapdh基因表達(dá)水平的變化，二甲雙胍治療下調(diào)了它們的表達(dá)(圖1b-d)。這些基因在乳酸代謝中起著至關(guān)重要的作用，其下調(diào)暗示著對(duì)乳酸代謝率的潛在影響，表明二甲雙胍可能通過影響這些乳酸酶相關(guān)基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)乳酸代謝。

在蛋白水平上，通過檢測(cè)斑馬魚組蛋白的泌乳水平，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍顯著下調(diào)了H3組蛋白的泌乳修飾，尤其是H3K18位點(diǎn)( 圖1e–g)。結(jié)合斑馬魚和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，二甲雙胍影響斑馬魚中乳酸酶相關(guān)基因，并下調(diào)組蛋白乳酸化。

圖1 

此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)H3K18乳酸化通過增加活性氧水平，來影響中性粒細(xì)胞募集。與對(duì)照組相比，乳酸組總體乳酸化水平、H3K18乳酸化水平顯著升高(圖2a-c)，而當(dāng)乳酸和二甲雙胍聯(lián)合使用時(shí)，乳酸誘導(dǎo)的上調(diào)被有效抑制；乳酸顯著提高了 pkma和 gapdh基因( 圖2d, e)，而在同時(shí)使用乳酸和二甲雙胍組中，這些基因的表達(dá)明顯受到抑制，進(jìn)一步證明了二甲雙胍調(diào)節(jié)乳酸化修飾的能力。乳酸不僅增加了斑馬魚體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生( 圖6f,g)，也顯著上調(diào)氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá) duox和 sod1。這些結(jié)果表明，乳酸可能通過激活氧化應(yīng)激途徑來調(diào)節(jié)活性氧的產(chǎn)生。

通過急性炎癥模型發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚乳酸處理后，乳酸組均表現(xiàn)出中性粒細(xì)胞的顯著增加，二甲雙胍的加入削弱了中性粒細(xì)胞的遷移，從而減少了體內(nèi)的炎癥反應(yīng)( 圖2j-q)。這些發(fā)現(xiàn)與之前活性氧水平升高的研究結(jié)果一致，表明乳酸可能通過上調(diào)活性氧水平來影響中性粒細(xì)胞的遷移行為。

圖2

04、利用斑馬魚等揭示Vps34乳酸化促進(jìn)自噬調(diào)控機(jī)制

文章題目

ULK1-mediated metabolic reprogramming Regulates Vps34 Lipid Kinase Activity by its lactylation

雜志：Science Advances（IF=13.6）

發(fā)表時(shí)間：2023年6月2日

作者：程俠衛(wèi)等

單位：華東理工大學(xué)藥學(xué)院等

文章主題：

自噬和糖酵解是高度保守的生物過程，涉及生理和病理細(xì)胞程序，有研究表明，磷酸化、乙?；?、泛素化修飾等PTM會(huì)影響自噬核心蛋白分子的結(jié)構(gòu)、活性以及功能。ULK1作為參與自噬早期至晚期的最關(guān)鍵的蛋白激酶，ULK1介導(dǎo)的代謝重編程是否通過其乳?；{(diào)節(jié)Vps34脂質(zhì)激酶活性？乳酸介導(dǎo)的乳酸化是否參與調(diào)節(jié)自噬機(jī)制？目前還知之甚少。

本研究中，研究人員利用斑馬魚等闡述了自噬調(diào)控機(jī)制，進(jìn)而將細(xì)胞自噬與糖酵解結(jié)合起來。研究發(fā)現(xiàn)，糖酵解酶乳酸脫氫酶A（lactate dehydrogenase A，LDHA）在營(yíng)養(yǎng)缺少時(shí)在UNC-51樣激酶1（UNC-51–like kinase 1，ULK1）激活時(shí)被激活。具體來說，ULK1直接與LDHA相互作用，在營(yíng)養(yǎng)稀缺時(shí)磷酸化絲氨酸-196并促進(jìn)乳酸的產(chǎn)生。乳酸通過 Vps34 乳化作用（賴氨酸-356 和賴氨酸-781）將自噬和糖酵解連接起來，這種作用由?；D(zhuǎn)移酶 KAT5/TIP60 介導(dǎo)。Vps34 乳?；鰪?qiáng)了 Vps34 與 Beclin1、Atg14L 和 UVRAG 的結(jié)合，進(jìn)而提高了 Vps34 脂質(zhì)激酶的活性。Vps34 乳酸化可促進(jìn)自噬通量和溶酶體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)骨骼肌中的Vps34 乳酸化，以維持肌肉細(xì)胞的平衡，并通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬與癌癥進(jìn)展相關(guān)。

值得注意的是，LDHAS196是一種保守的殘留物，從斑馬魚到人類，并且在LDHA空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）質(zhì)子受體中靠近組氨酸位點(diǎn)的環(huán)域中發(fā)現(xiàn)了這種殘基。因此，研究人員推測(cè)絲氨酸-196處LDHA的磷酸化引起了環(huán)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化，有利于組氨酸殘基與NADH的相互作用。

圖1 

作為健康美麗產(chǎn)業(yè)CRO服務(wù)開拓者與引領(lǐng)者、斑馬魚生物技術(shù)的全球領(lǐng)導(dǎo)者，環(huán)特生物搭建了“斑馬魚、類器官、哺乳動(dòng)物、人體”四位一體的綜合技術(shù)服務(wù)體系，開展健康美麗CRO服務(wù)、科研服務(wù)、智慧實(shí)驗(yàn)室搭建三大業(yè)務(wù)。目前，環(huán)特已建立200多種斑馬魚模型及腦類器官、心臟類器官及各種腫瘤類器官培養(yǎng)平臺(tái)，歡迎有需要的讀者垂詢！