利用斑馬魚模型評價濕性黃斑變性防治作用

【評價原理】

臨床上顯示常見的青光眼視神經(jīng)病變、糖尿病性視網(wǎng)膜病變以及視網(wǎng)膜中央動靜脈阻塞等疾病的發(fā)生都與缺氧有關系。組織的缺氧被視為視網(wǎng)膜血管疾病的重要原因，而與血管相關的視網(wǎng)膜疾病恰恰是臨床上導致視力喪失的最主要原因。斑馬魚視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)與人類高度相似，這使得斑馬魚胚胎能夠模擬視網(wǎng)膜新生血管，為在短時間內(nèi)快速評估功效提供了模型。

氯化鈷是廣泛使用的化學缺氧模擬劑，其鈷可以取代特定前體羥化酶中的鐵離子，使羥化活性失活。缺氧條件下，能夠誘導轉(zhuǎn)錄因子（hif）和血管內(nèi)皮生長因子（vegf）的表達，誘發(fā)新生血管形成。

改善濕性黃斑變性有3個指標：（1）采用轉(zhuǎn)基因血管內(nèi)皮細胞綠色熒光斑馬魚，可在熒光顯微鏡在觀察到缺氧的斑馬魚視網(wǎng)膜血管明顯增多增粗；（2）同時制作病理切片，進行蘇木素-伊紅染色，觀察視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)變化；（3）檢測hif、vegf基因相對表達量。

【實驗方案】

我們將受測試斑馬魚分成三組，分別是正常對照組、模型對照組和黃斑變性藥物組。其中正常對照組未攝入氯化鈷，模型對照組與黃斑變性藥物組都攝入了等量的氯化鈷（氯化鈷通過溶于魚水的方式攝入到斑馬魚體內(nèi)）。黃斑變性藥物組在攝入氯化鈷的同時給予施圖倫滴眼液、貝伐單抗之類的黃斑變性藥物。

服用/注射一段時間黃斑變性藥物后，我們在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚視網(wǎng)膜血管的變化，制作成病理切片觀察視網(wǎng)膜的病理結(jié)構(gòu)變化，檢測hif、vegf基因相對表達量。

【結(jié)果展示】

圖1. 斑馬魚視網(wǎng)膜血管表型圖

可以看到，服用/注射黃斑變性藥物組的視網(wǎng)膜血管面積與正常對照組比較相似，沒有明顯的血管增多增粗。

圖2. 視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)表型圖

從病理切片中也能看出來，模型斑馬魚眼睛病理切片的色素上皮層和外核層結(jié)構(gòu)紊亂、變薄，而服用/注射黃斑變性藥物組的色素上皮層和外核層結(jié)構(gòu)均有所恢復。

圖3. hif-1α基因相對表達量

可以看到，模型斑馬魚hif-1α基因表達顯著升高，服用/注射黃斑變性藥物組該基因明顯下降。

【評價結(jié)論】

1.經(jīng)過每組30尾斑馬魚的對比實驗，服用/注射黃斑變性藥物組與模型對照組比較，視網(wǎng)膜血管明顯變細、視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)較正常、hif-1α基因表達下調(diào)。

2.本實驗證實了施圖倫滴眼液、貝伐單抗具有明顯的濕性黃斑變性防治作用。