利用斑馬魚模型評(píng)價(jià)生殖毒性

      【評(píng)價(jià)原理】

      斑馬魚成魚體長5 cm左右,其胚胎透明,在受精72 h后完成孵化,并在孵出后3個(gè)月內(nèi)性成熟。成年斑馬魚的繁殖周期短(一般7 d左右),若條件適宜,成年雌性斑馬魚可定期產(chǎn)卵(每次200~300個(gè))。在斑馬魚的早期胚胎及幼體的發(fā)育過程中,尚無性別分化,原始性腺都是相同的且具有雙向發(fā)育的潛能,易受環(huán)境(溫度、光照、pH值等)因素的影響而改變其遺傳性別。

      對(duì)于雌性斑馬魚而言,產(chǎn)卵量是評(píng)價(jià)其繁殖力的常用生物指標(biāo),它與魚類繁殖過程中的多個(gè)環(huán)節(jié)(卵子發(fā)育、雌雄交配行為、性激素刺激等)相關(guān),并對(duì)環(huán)境化學(xué)物質(zhì)具有高敏感性,能直接反應(yīng)魚類繁殖力變化。環(huán)境化學(xué)物質(zhì)除了直接對(duì)親代斑馬魚的生殖系統(tǒng)造成損害,還可能對(duì)其子代的正常生長發(fā)育。

      卵黃蛋白原在斑馬魚雌魚成熟過程中發(fā)揮重要作用,成熟雌魚在體內(nèi)17β-雌二醇的刺激下,由肝臟合成的VTG經(jīng)過血液到達(dá)卵巢并加工成卵黃蛋白,促進(jìn)性腺發(fā)育。幼魚和雄魚在正常情況下不合成VTG,但在受到雌激素和類雌激素刺激時(shí)能合成VTG,導(dǎo)致魚體內(nèi)VTG濃度升高,出現(xiàn)雌性體征。

      魚類的性腺發(fā)育和繁殖行為受到下丘腦-垂體-性腺軸(HPG 軸)的調(diào)控。下丘腦分泌促性腺激素釋放激素(GnRH),其作用于腦垂體,刺激其分泌促黃體生成素(LH)和促卵泡素(FSH),這兩種激素通過血液循環(huán)與相應(yīng)的受體結(jié)合后作用于性腺,刺激性腺產(chǎn)生睪酮(T)、17β-雌二醇(E2)和 11-酮基睪酮(11-KT) 等類固醇激素,進(jìn)而促進(jìn)精子和卵子的發(fā)育和成熟。

      【實(shí)驗(yàn)方案】

      我們將受測(cè)試斑馬魚分成兩組,進(jìn)行21天的暴露實(shí)驗(yàn),分別是正常對(duì)照組和服用供試品組(供試品通過溶解到養(yǎng)魚用水中或灌胃的方式攝入到斑馬魚體內(nèi))。

      服用一段時(shí)間供試品后,觀察每次的產(chǎn)卵量、受精率及孵化率;對(duì)受精卵進(jìn)行子一代發(fā)育毒性與致畸性評(píng)價(jià)。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)取斑馬魚的組織,檢測(cè)卵黃蛋白原(VTG)含量及相關(guān)基因表達(dá),并對(duì)性腺進(jìn)行病理組織學(xué)檢查,指標(biāo)主要包括:睪丸卵母細(xì)胞、睪丸間質(zhì)細(xì)胞增生、卵黃形成減少、精原細(xì)胞和濾泡增生;其他性腺損傷包括:卵母細(xì)胞閉鎖、睪丸變性和分期改變。

      【結(jié)果展示】

      圖1. 供試品對(duì)斑馬魚體內(nèi)卵黃蛋白原(VTG)的影響

      可以看到,供試品組VTG有下降趨勢(shì),但與正常對(duì)照組比較沒有顯著性差異。

       

      圖2. 斑馬魚發(fā)育毒性與致畸性表型圖

      可以看到,供試品組斑馬魚誘發(fā)眼睛變小,下頜異常,心血管毒性等。

       

      圖3. 斑馬魚性腺病理切片

      可以看到,供試品組斑馬魚精巢精子量變少,卵巢中卵母細(xì)胞體積變小、數(shù)量減少 。

      圖4. 供試品對(duì)斑馬魚基因表達(dá)的影響

      可以看到,供試品組FSHβ、LHβ基因相較于正常對(duì)照組顯著表達(dá)。

      【評(píng)價(jià)結(jié)論】

      1.經(jīng)過各組斑馬魚的對(duì)比實(shí)驗(yàn),攝入供試品組的斑馬魚體內(nèi)VTG有下降趨勢(shì),子一代斑馬魚有致畸性,性腺病理切片有不同程度的異常,與性腺發(fā)育和繁殖行為相關(guān)基因的上調(diào)。

      2.本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該供試品對(duì)斑馬魚有生殖毒性。

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